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摘要：目的 建立反相高效液相色谱法测定人工虫草和天然虫草中麦角甾醇的含量。方法 采用Diamonsil C18（2）色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（98∶2），检测波长280 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min。结果 麦角甾醇进样量在0.197 7～3.954 9 μg范围内与峰面积呈良好线性关系（r=1.000），平均加样回收率为99.51%，RSD=0.56%（n=9）。结论 本方法操作简便、灵敏、准确，具有良好的重复性和稳定性，适用于人工虫草和天然虫草中麦角甾醇的含量测定。
关键词：麦角甾醇；人工北虫草；发酵虫草菌粉；冬虫夏草；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0067-03
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis （Berk） Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，为我国传统名贵中药材，主产于西藏、青海的高寒草甸。近年来，由于对野生冬虫夏草的过度采挖，导致虫草资源逐渐枯竭，人工虫草的培育研究应运而生。冬虫夏草的人工替代途径包括有性型人工培养和无性型人工培养。有性型全人工培植冬虫夏草没有解决虫与菌的接种和批量、重复长出子座体的难关。目前，主要以无性型人工培养为主，利用从冬虫夏草体中分离出的虫草菌无性型若干种，进行深层大规模发酵培养及固体培养菌丝体和分生孢子体，作为有性型冬虫夏草的代用品。人工北虫草又称北冬虫夏草、蛹虫草（Cordyceps militaris），是从天然北虫草分离得到的菌种拟青霉（Paecilomyces militaris）经人工培养所获得的子实体，与冬虫夏草同属异种。
人工虫草与天然虫草的化学成分和药理作用相似，都具有增强肌体免疫力和抗衰老、抗疲劳、抗菌、抗肿瘤以及补肾壮阳、润肌美容、延年益寿等医疗保健作用[1]。虫草中的主要的化学成分有核苷类、甾醇类、氨基酸、甘露醇、多糖和微量元素等。麦角甾醇（ergosterol）作为甾醇化合物中的一种，为真菌类的特征甾醇，是一种重要的维生素D2原。文献报道的麦角甾醇含量测定方法有薄层扫描法和高效液相色谱法[2-4]。本研究采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定10批人工北虫草样品、12批发酵虫草菌粉和11批天然虫草中麦角甾醇的含量，为控制人工虫草的质量提供依据。
1 仪器与试药
SHIMADZU LC-20A高效液相色谱仪（日本SHIMADZU公司），LC-20AT泵，SPD-20A UV检测器， SOLUTION工作站；METTLER TOLEDO XP105电子天平， Milli-Q Plus超纯水制备系统，KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Anke TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
样品：人工北虫草1（北京市卫生局临床药学研究所培养），人工北虫草2～8（购于北京市场），人工北虫草9（吉林蚕业研究所培养），人工北虫草10（烟台惠众生物科技有限公司提供）；发酵虫草菌粉1～6（青海珠峰虫草药业有限公司提供），发酵虫草菌粉7～12（杭州中美华东制药有限公司生产）；冬虫夏草1（购于西藏），冬虫夏草2～5（购于北京白塔寺药店），冬虫夏草6～10（购于北京同仁堂药店），冬虫夏草11（购于青海）。麦角甾醇对照品（批号111845-201102，含量97.7%）购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯（美国Fisher Scientific），水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Diamonsil C18（2）色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（98∶2），流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃。理论板数按麦角甾醇峰计算应不低于6000。
2.2 对照品溶液的制备
取麦角甾醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.20 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取虫草样品，置于 50 ℃干燥箱中加热24 h，取出，放入干燥器中冷至室温，粉碎，过4号筛，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 系统适应性试验
分别取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下，注入液相色谱仪测定，记录色谱图，见图1。麦角甾醇与其他化学成分能达到基线分离，理论塔板数以麦角甾醇峰计为6000。
2.5 线性关系考察
精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20 ?L注入液相色谱仪，在“2.1”项色谱条件下测定，记录峰面积积分值。以麦角甾醇进样量（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=-3120.829 289+1 441 228.761X，r=1.000，表明麦角甾醇在0.197 7～3.954 9 μg范围内线性关系良好。
2.6 精密度考察
精密吸取同一对照品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下，连续进样测定6次，根据测定的麦角甾醇峰面积的结果计算RSD=0.15%（n=6），说明精密度良好。精密量取麦角甾醇对照品溶液，采用递减稀释的方法进行测定，按麦角甾醇与基线噪音峰面积S/N=10∶1作为定量限，计算得麦角甾醇的定量限为12.268 μg/g。
2.7 重复性考察
取虫草子实体样品0.5 g，精密称定，共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定，RSD=0.47%（n=6）。结果表明，方法的重复性较好。 2.8 稳定性考察
取同一供试品溶液，分别于0、2、5、8、16、24 h进样10 μL，在“2.1”项色谱条件下测定麦角甾醇峰面积积分值，计算RSD=0.53%。表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。
2.9 加样回收率考察
取已知麦角甾醇含量的人工北虫草样品（含量0.466 3%）0.25 g，精密称定，共9份，每3份为1组，每组分别精密加入相当于样品含量的80%、100%、120%对照品溶液（麦角甾醇含量为0.035 98、0.04944、0.056 27 mg/mL）25 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，进样20 μL，测定。结果见表1。
2.10 样品含量测定
取10批（3个产地）人工北虫草、12批发酵虫草菌粉（2个产地）、11批冬虫夏草，按“2.3”项下方法制备，分别注入液相色谱仪，测定样品中麦角甾醇的含量。结果见表2。
3 讨论
色谱条件的选择考察了麦角甾醇的紫外吸收，在274、280 nm均有最大吸收，结合文献[1]，确定检测波长为280 nm。试验中考察了甲醇-水、乙腈-水等流动相系统，结果以甲醇-水（98∶2）为流动相时麦角甾醇的色谱峰分离较好。
麦角甾醇为脂溶性物质，故以甲醇为提取溶媒。以麦角甾醇含量为考察指标，在样品制备方法考察中，分别考察提取溶媒用量（10、25、50 mL）、提取方式（加热回流、超声处理）、回流时间（10、20、30、60、90、120 min）等，结果表明，取虫草0.5 g，加甲醇25 mL，加热回流30 min，提取效率最佳。
试验中对方法耐用性进行了考察，在标准条件的基础上，对流速、柱温、检测波长、流动相比例的微小变化进行了考察，结果表明，流速、柱温、检测波长、流动相比例的微小变化对含量结果基本没有影响，方法的耐用性较好。
人工北虫草中麦角甾醇的含量（0.39%～0.60%，平均值0.51%）与发酵虫草菌粉（0.30%～1.38%，平均值0.53%）接近，远高于天然冬虫夏草（0.001 8%～0.50%，平均值0.17%），提示人工虫草与天然虫草中麦角甾醇成分的含量有明显差异。因此，有必要建立麦角甾醇的含量测定方法，以有效评价不同产地人工北虫草、发酵虫草菌粉和天然虫草的质量。
方法学考察表明，本研究建立的HPLC定量测定方法灵敏、快速、准确，适用于人工北虫草、发酵虫草菌粉和天然虫草的质量控制，为人工虫草的合理开发、质量评价提供了依据。
参考文献：
[1] 张萍，肖新月，黄玮，等.RP-HPLC-UV法测定5种发酵虫草制剂中麦角甾醇的含量[J].药物分析杂志，2011，31（2）：258-260.
[2] 李绍平，李萍，季晖，等.RP-HPLC测定天然与人工冬虫夏草中游离麦角甾醇的含量[J].中国现代应用药学杂志，2001，18（4）：297-298.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：106.
[4] 李云华，李修禄.用高效液相色谱法测定冬虫夏草及虫草乌鸡胶囊中麦角甾醇的含量[J].药学学报，1991，26（10）：768.
（收稿日期：2013-09-02，编辑：陈静）
关键词：麦角甾醇；人工北虫草；发酵虫草菌粉；冬虫夏草；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0067-03
冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis （Berk） Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体，为我国传统名贵中药材，主产于西藏、青海的高寒草甸。近年来，由于对野生冬虫夏草的过度采挖，导致虫草资源逐渐枯竭，人工虫草的培育研究应运而生。冬虫夏草的人工替代途径包括有性型人工培养和无性型人工培养。有性型全人工培植冬虫夏草没有解决虫与菌的接种和批量、重复长出子座体的难关。目前，主要以无性型人工培养为主，利用从冬虫夏草体中分离出的虫草菌无性型若干种，进行深层大规模发酵培养及固体培养菌丝体和分生孢子体，作为有性型冬虫夏草的代用品。人工北虫草又称北冬虫夏草、蛹虫草（Cordyceps militaris），是从天然北虫草分离得到的菌种拟青霉（Paecilomyces militaris）经人工培养所获得的子实体，与冬虫夏草同属异种。
人工虫草与天然虫草的化学成分和药理作用相似，都具有增强肌体免疫力和抗衰老、抗疲劳、抗菌、抗肿瘤以及补肾壮阳、润肌美容、延年益寿等医疗保健作用[1]。虫草中的主要的化学成分有核苷类、甾醇类、氨基酸、甘露醇、多糖和微量元素等。麦角甾醇（ergosterol）作为甾醇化合物中的一种，为真菌类的特征甾醇，是一种重要的维生素D2原。文献报道的麦角甾醇含量测定方法有薄层扫描法和高效液相色谱法[2-4]。本研究采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定10批人工北虫草样品、12批发酵虫草菌粉和11批天然虫草中麦角甾醇的含量，为控制人工虫草的质量提供依据。
1 仪器与试药
SHIMADZU LC-20A高效液相色谱仪（日本SHIMADZU公司），LC-20AT泵，SPD-20A UV检测器， SOLUTION工作站；METTLER TOLEDO XP105电子天平， Milli-Q Plus超纯水制备系统，KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Anke TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
样品：人工北虫草1（北京市卫生局临床药学研究所培养），人工北虫草2～8（购于北京市场），人工北虫草9（吉林蚕业研究所培养），人工北虫草10（烟台惠众生物科技有限公司提供）；发酵虫草菌粉1～6（青海珠峰虫草药业有限公司提供），发酵虫草菌粉7～12（杭州中美华东制药有限公司生产）；冬虫夏草1（购于西藏），冬虫夏草2～5（购于北京白塔寺药店），冬虫夏草6～10（购于北京同仁堂药店），冬虫夏草11（购于青海）。麦角甾醇对照品（批号111845-201102，含量97.7%）购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯（美国Fisher Scientific），水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Diamonsil C18（2）色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（98∶2），流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃。理论板数按麦角甾醇峰计算应不低于6000。
2.2 对照品溶液的制备
取麦角甾醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.20 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取虫草样品，置于 50 ℃干燥箱中加热24 h，取出，放入干燥器中冷至室温，粉碎，过4号筛，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 系统适应性试验
分别取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下，注入液相色谱仪测定，记录色谱图，见图1。麦角甾醇与其他化学成分能达到基线分离，理论塔板数以麦角甾醇峰计为6000。
2.5 线性关系考察
精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20 ?L注入液相色谱仪，在“2.1”项色谱条件下测定，记录峰面积积分值。以麦角甾醇进样量（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=-3120.829 289+1 441 228.761X，r=1.000，表明麦角甾醇在0.197 7～3.954 9 μg范围内线性关系良好。
2.6 精密度考察
精密吸取同一对照品溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下，连续进样测定6次，根据测定的麦角甾醇峰面积的结果计算RSD=0.15%（n=6），说明精密度良好。精密量取麦角甾醇对照品溶液，采用递减稀释的方法进行测定，按麦角甾醇与基线噪音峰面积S/N=10∶1作为定量限，计算得麦角甾醇的定量限为12.268 μg/g。
2.7 重复性考察
取虫草子实体样品0.5 g，精密称定，共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定，RSD=0.47%（n=6）。结果表明，方法的重复性较好。 2.8 稳定性考察
取同一供试品溶液，分别于0、2、5、8、16、24 h进样10 μL，在“2.1”项色谱条件下测定麦角甾醇峰面积积分值，计算RSD=0.53%。表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。
2.9 加样回收率考察
取已知麦角甾醇含量的人工北虫草样品（含量0.466 3%）0.25 g，精密称定，共9份，每3份为1组，每组分别精密加入相当于样品含量的80%、100%、120%对照品溶液（麦角甾醇含量为0.035 98、0.04944、0.056 27 mg/mL）25 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，进样20 μL，测定。结果见表1。
2.10 样品含量测定
取10批（3个产地）人工北虫草、12批发酵虫草菌粉（2个产地）、11批冬虫夏草，按“2.3”项下方法制备，分别注入液相色谱仪，测定样品中麦角甾醇的含量。结果见表2。
3 讨论
色谱条件的选择考察了麦角甾醇的紫外吸收，在274、280 nm均有最大吸收，结合文献[1]，确定检测波长为280 nm。试验中考察了甲醇-水、乙腈-水等流动相系统，结果以甲醇-水（98∶2）为流动相时麦角甾醇的色谱峰分离较好。
麦角甾醇为脂溶性物质，故以甲醇为提取溶媒。以麦角甾醇含量为考察指标，在样品制备方法考察中，分别考察提取溶媒用量（10、25、50 mL）、提取方式（加热回流、超声处理）、回流时间（10、20、30、60、90、120 min）等，结果表明，取虫草0.5 g，加甲醇25 mL，加热回流30 min，提取效率最佳。
试验中对方法耐用性进行了考察，在标准条件的基础上，对流速、柱温、检测波长、流动相比例的微小变化进行了考察，结果表明，流速、柱温、检测波长、流动相比例的微小变化对含量结果基本没有影响，方法的耐用性较好。
人工北虫草中麦角甾醇的含量（0.39%～0.60%，平均值0.51%）与发酵虫草菌粉（0.30%～1.38%，平均值0.53%）接近，远高于天然冬虫夏草（0.001 8%～0.50%，平均值0.17%），提示人工虫草与天然虫草中麦角甾醇成分的含量有明显差异。因此，有必要建立麦角甾醇的含量测定方法，以有效评价不同产地人工北虫草、发酵虫草菌粉和天然虫草的质量。
方法学考察表明，本研究建立的HPLC定量测定方法灵敏、快速、准确，适用于人工北虫草、发酵虫草菌粉和天然虫草的质量控制，为人工虫草的合理开发、质量评价提供了依据。
参考文献：
[1] 张萍，肖新月，黄玮，等.RP-HPLC-UV法测定5种发酵虫草制剂中麦角甾醇的含量[J].药物分析杂志，2011，31（2）：258-260.
[2] 李绍平，李萍，季晖，等.RP-HPLC测定天然与人工冬虫夏草中游离麦角甾醇的含量[J].中国现代应用药学杂志，2001，18（4）：297-298.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：106.
[4] 李云华，李修禄.用高效液相色谱法测定冬虫夏草及虫草乌鸡胶囊中麦角甾醇的含量[J].药学学报，1991，26（10）：768.
（收稿日期：2013-09-02，编辑：陈静）