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摘要：目的 考察复方中药制剂发酵过程中的影响因素，通过单因素试验及响应面法，确定其最佳发酵工艺。方法 通过控制复方中药发酵过程中的因素（如发酵菌种、发酵时间、发酵温度、接种量等），采用高效液相色谱法（HPLC），以其总峰面积提高率为指标，对发酵前后醇提液进行监控和对比评价，并采用响应面法确定其最佳发酵工艺。结果 经单因素试验及响应面法确定的最佳发酵工艺为：以SZ-2为发酵菌种，温度33 ℃，接种量4%，发酵3.5 d，其总峰面积提高率平均可达31.24%。结论 可以用HPLC指纹图谱对不同影响因素下的复方中药制剂发酵进行对比及评价，并通过响应面法明确其最佳发酵工艺，为其发酵工艺开发提供了参考。
关键词：复方中药；发酵工艺；高效液相色谱法；单因素试验；响应面法
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0073-05
中药经净制或处理后，在一定温度和湿度条件下，利用霉菌和酶的催化分解作用，使药物发泡、生衣的方法称为发酵法[1]。发酵是一种重要的炮制方法，目的是改变原有药性，产生新的治疗作用，扩大药物品种，并具有去毒存效、增强药效、提高中药提取率等作用[2]。随着生物技术的不断发展以及微生物越来越受到广泛关注，微生物发酵为中药炮制的发展开辟了新的研究空间。但传统的中药发酵采用天然微生物发酵，菌种不纯，代谢理论、药效成分理念模糊不清，生产可控性差，且发酵中药所包含的成分极其复杂，对其成分分离纯化有较大难度，中药发酵研究有限，投入生产的品种更少。鉴于发酵类中药成分复杂，缺乏指标性成分，以高效液相色谱法（HPLC）测定发酵后醇提液的总峰面积来代表发酵后总有效化学成分含量，对复方中药制剂质量评价有一定的参考意义。
本试验以某企业委托的一种复方中药制剂为研究对象，因其传统的发酵炮制工艺生产周期较长，且制剂的质量难以控制，故通过对复方中药发酵过程中影响因素（如发酵菌种、发酵时间、发酵温度、接种量等）进行优化筛选，并采用HPLC分离分析技术测定，对发酵前后醇提液进行监控和对比评价，由响应面法分析确定最佳发酵工艺，为复方中药发酵工艺开发提供一定的基础和参考。
1 仪器与试药
Surveryor高效液相色谱分析仪（美国 Finnigan）， SHP生化培养箱、净化工作台（扬州鸿都电子有限公司），ZD-85气浴恒温振荡器（金坛市荣华仪器制造有限公司），HH-S4型电热恒温水浴锅、DZF型真空干燥箱（北京利伟永兴仪器有限公司），RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。分析纯乙醇，色谱甲醇以及无菌水。
复方中药及其组方药味由某公司提供（委托方要求复方中药及组方保密）；发酵菌种为酒曲，均来自市场商品，分别为醇正醇牌第四代“高效增香型酒曲”（哈尔滨醇正醇酒曲厂）、苏州蜜蜂牌“甜酒曲”（苏州粮油食品有限公司）、安琪牌“甜酒曲”HY12-11、ANGEL、Q/YB2002S（安琪酵母股份有限公司），分别命名为CZC-4、SZ-2、AQ-1、AQ-2、AQ-3。
2 方法
2.1 工艺流程
2.2 工艺要点
2.2.1 浸泡、蒸煮及灭菌 精确称取复方中药原料5.000 5 g，加无菌水至药材表面，浸泡2～3 h，高温（100 ℃）蒸煮1～2 h，至水分被药材完全吸收，密封置于紫外灯下灭菌，待温度降至室温时，放置无菌恒温箱（33 ℃）中备用。
2.2.2 活化 精确称取发酵菌种0.150 5 g，置于灭菌后的试管中，于净化工作台上加入约3 mL无菌水，加棉花塞，放置恒温振荡器中，500 r/min，活化0.5 h。
2.2.3 接种 取出恒温箱中药材（发酵培养基），将活化后的菌种倒置药材表面，边搅拌，边接种。再用少许无菌水将试管壁上的菌种涮下。上述操作过程尽可能迅速完成，以确保菌种的发酵温度维持在一个最适的范围，缩短发酵周期。
2.2.4 发酵 取出接种后的药材，密封置于恒温培养箱中，33 ℃发酵至醇香产生，一般为3～5 d。
2.2.5 制样 将发酵后的药材，按固液比1∶15，80%乙醇热回流提取2 h，提取2次，抽滤，收集滤液，经真空浓缩至膏状无醇味；将浓缩液浸膏用无水甲醇溶解洗涤，定量转移至250 mL容量瓶中，无水甲醇定容至刻度备用。
2.3 分离分析检测与评价依据
采用HPLC进行分离分析[3-4]，测定复方中药制剂中各组分的色谱峰面积，依据各组分色谱峰面积的变化来评价复方中药制剂发酵炮制效果的优劣，色谱峰面积越大说明发酵后有效化学成分含量越高，复方中药制剂有效成分越优良。
2.4 色谱条件
色谱柱：Thermo HYPERSIL GOLD C18（150 mm×2.1 mm， 3 μm）；流动相A为乙腈、B为1.0%甲酸水。采用全梯度洗脱模式，优化的梯度洗脱条件如下：0 min，3%A；15 min，15%A；35 min，50%A；60 min，100%A；63 min， 100%A；65 min，3%A；75 min，3%A。流速：0.2 mL/min；检测波长：257 nm；柱温：35 ℃。
2.5 发酵前后指纹图谱对比
精确称取复方中药各组成药味，共5.000 5 g，按上述检测工艺，对发酵前的原料进行HPLC分析。精确称取复方中药各组成药味，共5.000 5 g，按上述发酵及检测工艺，对发酵后的复方中药进行HPLC分析。
2.6 单因素试验
以甲醇定容后，采用HPLC测定复方中药制剂醇提液中的各组分色谱峰的总峰面积，以总峰面积提高率为评价指标，评价各影响因素下的发酵效果[5]。总峰面积提高率（%）=（发酵后总峰面积-发酵前总峰面积）÷发酵前总峰面积×100%。 2.6.1 菌种 以CZC-4、SZ-2、AQ-1、AQ-2、AQ-3为发酵菌种，接种量3%、发酵温度33 ℃、发酵3 d，以HPLC总峰面积提高率为评价指标，考察不同发酵菌种对复方中药发酵的影响。
2.6.2 接种量 以SZ-2菌种为发酵菌种，发酵温度33 ℃、发酵3 d，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%，以HPLC总峰面积提高率为评价指标，研究接种量对复方中药发酵的影响。
2.6.3 发酵时间 以SZ-2菌种为发酵菌种，发酵温度35 ℃、接种量为5%，发酵时间分别为1、2、3、4、5、6 d，以HPLC总峰面积提高率为评价指标，研究发酵时间对复方中药发酵的影响。
2.6.4 发酵温度 以SZ-2菌种为发酵菌种，接种量为5%，发酵时间3 d，发酵温度分别为30、31、32、33、34、35、36 ℃，以高HPLC总峰面积提高率为评价指标，研究发酵温度对复方中药发酵的影响。
2.7 响应面法优化发酵工艺
通过单因素试验，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，以复方中药制剂中各组分总峰面积的提高率为响应值，设计3因素3水平响应面分析试验，包括12个析因试验和3个中心试验。因素水平编码见表l。数据用Design-Expert 8.0程序分析确定最优发酵工艺参数[6-7]。
3.3.2 响应面分析 利用Design Expert 8.0软件对二次回归模型进行规范分析，以SZ-2菌种为发酵菌种，发酵温度、发酵时间、接种量之间交互作用对总峰面积提高率的影响见图6～图8。
等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱，圆形表示两因素不显著，而椭圆则表示较为显著[12]。比较3组等高线图可直观地看出：AC之间的交互作用显著，等高线呈椭圆形，而AB、BC等高线呈圆形，说明其交互作用不显著，这与方差分析结果一致。从响应面图可以看出此试验模型都能够达到极值点，且稳定点是最大值，即为总峰面积最大的点。
由图6可知，温度在（30，32.87）℃范围内、发酵时间在（1，3.46）d范围内时，两者存在显著增效作用，总峰面积的提高率随着温度和时间增加而升高；而当温度在（32.87，36）℃区间，发酵时间在（3.46，5）d范围时，酒精度反而随着两因素的增加开始下降。由图7可知，温度在（30，32.87）℃范围内，接种量在（1%，3.96%）范围内时，两者存在显著增效作用，总峰面积的提高率随着温度和接种量的增加而升高；而当温度在（32.87，36）℃区间，接种量在（3.96%，6%）区间，总峰面积的提高率反而随着两因素的增加开始下降。由图8可知，接种量在（1%，3.96%）范围内，发酵时间在（1，3.46）d范围时，两者存在着显著增效作用，总峰面积的提高率随着接种量和发酵时间的增加而升高；而当接种量在（3.96%，6%）范围时，发酵时间在（3.46，5）d范围时，总峰面积的提高率反而随着两因素的增加开始下降[13]。
4 小结
本研究通过单因素试验和响应面法对复方中药的发酵条件进行优化，建立了发酵时间、接种量和发酵温度3个因素对总峰面积提高率的二次回归方程模型，该模型准确有效，可用于分析预测各因素对总峰面积提高率的影响。由单因素试验和响应面优化模型确定了SZ-2菌种发酵复方中药的最佳工艺条件，进一步试验证明，采用响应面分析法对复方中药发酵工艺进行优化是非常有效的。本研究结果为复方中药发酵工艺开发提供了一定的基础和参考。
参考文献：
[1] 龚千峰.中药炮制学[M].北京：中国中医药出版社，2007：315.
[2] 张晓凤，杨西友，肖娇，等.中药发酵炮制的研究进展[C]//中华中医药学会中药炮制分会2009年学术研讨会论文集.北京：中华中医药学会， 2009：99-103.
[3] 崔淑芬，张信青，Frank SC Lee，等.HPLC指纹图谱应用于炙甘草的炮制研究[J].中成药，2007，29（11）：1636-1639.
[4] 廖庆文，樊冬丽，肖小河，等.不同黄连炮制品HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2007，32（3）：210-214.
[5] 白卫东，沈棚，钱敏，等.响应面优化花生酸奶发酵工艺研究[J].中国乳品工业，2012，40（4）：51-54.
[6] Elibol M， Ozer D. Response surface analysis of Lipase production by freely suspended Rhizopus Arrhizus[J]. Process Biochemistry， 2002，9（8）：367-372.
[7] Anisha GS， Sukumaran RK， Prema P. Evaluation of α-galactosidase biosynthesis by Streptomyces griseoloalbus in solid-state fermentation using response surface methodology[J]. Applied Microbiology，2008，46（3）：338-343.
[8] Martin Obandaa， P Okinda Owuora， Richard Mang'okab. Changes in the chemical and sensory quality parameters of black tea due to variations of fermentation time and temperature[J]. Food Chemistry，2001，75（4）：395-404.
[9] Son HJ， Heo MS， Kim YG， et al. Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry， 2001，33（1）：1-5.
[10] 宋燕，罗松明，向建军，等.响应面法优化花椒籽不可溶性膳食纤维提取工艺研究[J].中国油脂，2011，36（7）：62-67.
[11] 任天宝，马孝琴，徐桂转，等.响应面法优化玉米秸秆蒸汽爆破预处理条件[J].农业工程学报，2011，27（9）：282-286.
[12] 毋锐琴，杜双奎，李志西，等.细菌纤维素发酵培养基的优化及超微观结构分析[J].生物工程学报，2008，24（6）：1068-1074.
[13] 范兆军，牛广财，朱丹，等.响应面法优化沙棘果酒发酵条件的研究[J].食品与机械，2009，25（1）：41-45.
（收稿日期：2013-07-23，编辑：陈静）
关键词：复方中药；发酵工艺；高效液相色谱法；单因素试验；响应面法
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0073-05
中药经净制或处理后，在一定温度和湿度条件下，利用霉菌和酶的催化分解作用，使药物发泡、生衣的方法称为发酵法[1]。发酵是一种重要的炮制方法，目的是改变原有药性，产生新的治疗作用，扩大药物品种，并具有去毒存效、增强药效、提高中药提取率等作用[2]。随着生物技术的不断发展以及微生物越来越受到广泛关注，微生物发酵为中药炮制的发展开辟了新的研究空间。但传统的中药发酵采用天然微生物发酵，菌种不纯，代谢理论、药效成分理念模糊不清，生产可控性差，且发酵中药所包含的成分极其复杂，对其成分分离纯化有较大难度，中药发酵研究有限，投入生产的品种更少。鉴于发酵类中药成分复杂，缺乏指标性成分，以高效液相色谱法（HPLC）测定发酵后醇提液的总峰面积来代表发酵后总有效化学成分含量，对复方中药制剂质量评价有一定的参考意义。
本试验以某企业委托的一种复方中药制剂为研究对象，因其传统的发酵炮制工艺生产周期较长，且制剂的质量难以控制，故通过对复方中药发酵过程中影响因素（如发酵菌种、发酵时间、发酵温度、接种量等）进行优化筛选，并采用HPLC分离分析技术测定，对发酵前后醇提液进行监控和对比评价，由响应面法分析确定最佳发酵工艺，为复方中药发酵工艺开发提供一定的基础和参考。
1 仪器与试药
Surveryor高效液相色谱分析仪（美国 Finnigan）， SHP生化培养箱、净化工作台（扬州鸿都电子有限公司），ZD-85气浴恒温振荡器（金坛市荣华仪器制造有限公司），HH-S4型电热恒温水浴锅、DZF型真空干燥箱（北京利伟永兴仪器有限公司），RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。分析纯乙醇，色谱甲醇以及无菌水。
复方中药及其组方药味由某公司提供（委托方要求复方中药及组方保密）；发酵菌种为酒曲，均来自市场商品，分别为醇正醇牌第四代“高效增香型酒曲”（哈尔滨醇正醇酒曲厂）、苏州蜜蜂牌“甜酒曲”（苏州粮油食品有限公司）、安琪牌“甜酒曲”HY12-11、ANGEL、Q/YB2002S（安琪酵母股份有限公司），分别命名为CZC-4、SZ-2、AQ-1、AQ-2、AQ-3。
2 方法
2.1 工艺流程
2.2 工艺要点
2.2.1 浸泡、蒸煮及灭菌 精确称取复方中药原料5.000 5 g，加无菌水至药材表面，浸泡2～3 h，高温（100 ℃）蒸煮1～2 h，至水分被药材完全吸收，密封置于紫外灯下灭菌，待温度降至室温时，放置无菌恒温箱（33 ℃）中备用。
2.2.2 活化 精确称取发酵菌种0.150 5 g，置于灭菌后的试管中，于净化工作台上加入约3 mL无菌水，加棉花塞，放置恒温振荡器中，500 r/min，活化0.5 h。
2.2.3 接种 取出恒温箱中药材（发酵培养基），将活化后的菌种倒置药材表面，边搅拌，边接种。再用少许无菌水将试管壁上的菌种涮下。上述操作过程尽可能迅速完成，以确保菌种的发酵温度维持在一个最适的范围，缩短发酵周期。
2.2.4 发酵 取出接种后的药材，密封置于恒温培养箱中，33 ℃发酵至醇香产生，一般为3～5 d。
2.2.5 制样 将发酵后的药材，按固液比1∶15，80%乙醇热回流提取2 h，提取2次，抽滤，收集滤液，经真空浓缩至膏状无醇味；将浓缩液浸膏用无水甲醇溶解洗涤，定量转移至250 mL容量瓶中，无水甲醇定容至刻度备用。
2.3 分离分析检测与评价依据
采用HPLC进行分离分析[3-4]，测定复方中药制剂中各组分的色谱峰面积，依据各组分色谱峰面积的变化来评价复方中药制剂发酵炮制效果的优劣，色谱峰面积越大说明发酵后有效化学成分含量越高，复方中药制剂有效成分越优良。
2.4 色谱条件
色谱柱：Thermo HYPERSIL GOLD C18（150 mm×2.1 mm， 3 μm）；流动相A为乙腈、B为1.0%甲酸水。采用全梯度洗脱模式，优化的梯度洗脱条件如下：0 min，3%A；15 min，15%A；35 min，50%A；60 min，100%A；63 min， 100%A；65 min，3%A；75 min，3%A。流速：0.2 mL/min；检测波长：257 nm；柱温：35 ℃。
2.5 发酵前后指纹图谱对比
精确称取复方中药各组成药味，共5.000 5 g，按上述检测工艺，对发酵前的原料进行HPLC分析。精确称取复方中药各组成药味，共5.000 5 g，按上述发酵及检测工艺，对发酵后的复方中药进行HPLC分析。
2.6 单因素试验
以甲醇定容后，采用HPLC测定复方中药制剂醇提液中的各组分色谱峰的总峰面积，以总峰面积提高率为评价指标，评价各影响因素下的发酵效果[5]。总峰面积提高率（%）=（发酵后总峰面积-发酵前总峰面积）÷发酵前总峰面积×100%。 2.6.1 菌种 以CZC-4、SZ-2、AQ-1、AQ-2、AQ-3为发酵菌种，接种量3%、发酵温度33 ℃、发酵3 d，以HPLC总峰面积提高率为评价指标，考察不同发酵菌种对复方中药发酵的影响。
2.6.2 接种量 以SZ-2菌种为发酵菌种，发酵温度33 ℃、发酵3 d，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%，以HPLC总峰面积提高率为评价指标，研究接种量对复方中药发酵的影响。
2.6.3 发酵时间 以SZ-2菌种为发酵菌种，发酵温度35 ℃、接种量为5%，发酵时间分别为1、2、3、4、5、6 d，以HPLC总峰面积提高率为评价指标，研究发酵时间对复方中药发酵的影响。
2.6.4 发酵温度 以SZ-2菌种为发酵菌种，接种量为5%，发酵时间3 d，发酵温度分别为30、31、32、33、34、35、36 ℃，以高HPLC总峰面积提高率为评价指标，研究发酵温度对复方中药发酵的影响。
2.7 响应面法优化发酵工艺
通过单因素试验，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，以复方中药制剂中各组分总峰面积的提高率为响应值，设计3因素3水平响应面分析试验，包括12个析因试验和3个中心试验。因素水平编码见表l。数据用Design-Expert 8.0程序分析确定最优发酵工艺参数[6-7]。
3.3.2 响应面分析 利用Design Expert 8.0软件对二次回归模型进行规范分析，以SZ-2菌种为发酵菌种，发酵温度、发酵时间、接种量之间交互作用对总峰面积提高率的影响见图6～图8。
等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱，圆形表示两因素不显著，而椭圆则表示较为显著[12]。比较3组等高线图可直观地看出：AC之间的交互作用显著，等高线呈椭圆形，而AB、BC等高线呈圆形，说明其交互作用不显著，这与方差分析结果一致。从响应面图可以看出此试验模型都能够达到极值点，且稳定点是最大值，即为总峰面积最大的点。
由图6可知，温度在（30，32.87）℃范围内、发酵时间在（1，3.46）d范围内时，两者存在显著增效作用，总峰面积的提高率随着温度和时间增加而升高；而当温度在（32.87，36）℃区间，发酵时间在（3.46，5）d范围时，酒精度反而随着两因素的增加开始下降。由图7可知，温度在（30，32.87）℃范围内，接种量在（1%，3.96%）范围内时，两者存在显著增效作用，总峰面积的提高率随着温度和接种量的增加而升高；而当温度在（32.87，36）℃区间，接种量在（3.96%，6%）区间，总峰面积的提高率反而随着两因素的增加开始下降。由图8可知，接种量在（1%，3.96%）范围内，发酵时间在（1，3.46）d范围时，两者存在着显著增效作用，总峰面积的提高率随着接种量和发酵时间的增加而升高；而当接种量在（3.96%，6%）范围时，发酵时间在（3.46，5）d范围时，总峰面积的提高率反而随着两因素的增加开始下降[13]。
4 小结
本研究通过单因素试验和响应面法对复方中药的发酵条件进行优化，建立了发酵时间、接种量和发酵温度3个因素对总峰面积提高率的二次回归方程模型，该模型准确有效，可用于分析预测各因素对总峰面积提高率的影响。由单因素试验和响应面优化模型确定了SZ-2菌种发酵复方中药的最佳工艺条件，进一步试验证明，采用响应面分析法对复方中药发酵工艺进行优化是非常有效的。本研究结果为复方中药发酵工艺开发提供了一定的基础和参考。
参考文献：
[1] 龚千峰.中药炮制学[M].北京：中国中医药出版社，2007：315.
[2] 张晓凤，杨西友，肖娇，等.中药发酵炮制的研究进展[C]//中华中医药学会中药炮制分会2009年学术研讨会论文集.北京：中华中医药学会， 2009：99-103.
[3] 崔淑芬，张信青，Frank SC Lee，等.HPLC指纹图谱应用于炙甘草的炮制研究[J].中成药，2007，29（11）：1636-1639.
[4] 廖庆文，樊冬丽，肖小河，等.不同黄连炮制品HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2007，32（3）：210-214.
[5] 白卫东，沈棚，钱敏，等.响应面优化花生酸奶发酵工艺研究[J].中国乳品工业，2012，40（4）：51-54.
[6] Elibol M， Ozer D. Response surface analysis of Lipase production by freely suspended Rhizopus Arrhizus[J]. Process Biochemistry， 2002，9（8）：367-372.
[7] Anisha GS， Sukumaran RK， Prema P. Evaluation of α-galactosidase biosynthesis by Streptomyces griseoloalbus in solid-state fermentation using response surface methodology[J]. Applied Microbiology，2008，46（3）：338-343.
[8] Martin Obandaa， P Okinda Owuora， Richard Mang'okab. Changes in the chemical and sensory quality parameters of black tea due to variations of fermentation time and temperature[J]. Food Chemistry，2001，75（4）：395-404.
[9] Son HJ， Heo MS， Kim YG， et al. Optimization of fermentation conditions for the production of bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry， 2001，33（1）：1-5.
[10] 宋燕，罗松明，向建军，等.响应面法优化花椒籽不可溶性膳食纤维提取工艺研究[J].中国油脂，2011，36（7）：62-67.
[11] 任天宝，马孝琴，徐桂转，等.响应面法优化玉米秸秆蒸汽爆破预处理条件[J].农业工程学报，2011，27（9）：282-286.
[12] 毋锐琴，杜双奎，李志西，等.细菌纤维素发酵培养基的优化及超微观结构分析[J].生物工程学报，2008，24（6）：1068-1074.
[13] 范兆军，牛广财，朱丹，等.响应面法优化沙棘果酒发酵条件的研究[J].食品与机械，2009，25（1）：41-45.
（收稿日期：2013-07-23，编辑：陈静）