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摘要：目的 通过测定当归配方颗粒中阿魏酸含量、水分和浸出物含量，为评价及控制其质量提供可靠方法，并对当归配方颗粒及当归饮片的质量进行比较研究。方法 采用高效液相色谱法。色谱柱：Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：316 nm；柱温：28 ℃；流动相：乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱系统。结果 阿魏酸在0.033～0.165 μg（r=0.999 8）之间有良好的线性关系，平均加样回收率为98.78%，RSD=0.99%。当归配方颗粒在各项含量指标上符合质量要求，阿魏酸含量高于当归饮片。结论 当归配方颗粒中阿魏酸含量测定方法操作简单、可靠，重复性好，可作为当归配方颗粒质量控制的有效方法。
关键词：当归配方颗粒；当归饮片；阿魏酸；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0070-03
当归是伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.）Diels的干燥根，始载于《神农本草经》，列为上品。当归味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，主要功效为补血活血、调经止痛、润肠通便，广泛应用于临床各科[1]。当归配方颗粒由当归单味药加工制成，其性味、归经、功效与原饮片基本一致，用于中医临床配方，既可满足临床辨证论治、随证加减的需要，又具有免煎易服、作用迅速、安全卫生和携带方便等优点，具有很好的应用前景[2-3]。
当归主要含有挥发油、有机酸、生物碱、酚类等多种成分[4]，有机酸中的阿魏酸为水溶性有效成分，因其可溶于水、醇、醋酸乙酯等溶剂，在制剂中容易被提取出来，但也易被各种因素（氧化、水解）破坏[5]，阿魏酸是公认的天然抗氧化剂，也是近年来国际认的防癌物质，与藁本内酯一同被认为是当归药理作用的主要物质基础[6]，故可通过测定阿魏酸含量来评价当归的质量。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定当归配方颗粒和饮片中的阿魏酸含量，并测定水分和浸出物含量，考察当归配方颗粒的质量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（Aglient液相色谱仪1200），电热风干燥器（中国重庆试验设备制造，CS101-1），气流烘干器（河南省巩义市甘埔仪器厂，B-20头），分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，BS2245），超声清洗机（上海新苗医疗器械厂，B*7200HP），万能粉碎机（北京利伟永兴仪器有限公司，FW-400A）。
阿魏酸对照品（纯度>98%，中国药品生物制品检定所，批号1100-201112）；当归饮片（购于兰州惠仁堂，产地：岷县，批号1112041M），经甘肃中医学院药学系生药教研室李成义教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；当归配方颗粒（广东一方制药有限公司，批号1201021）。无水乙醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），水（娃哈哈纯净水），乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司），甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司），磷酸（优级纯，北京益利精细化学品有限公司）。
2 方法与结果
2.1 阿魏酸含量测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min，检测波长：316 nm；柱温：28 ℃；流动相：乙腈（A）- 0.05%磷酸水（B）梯度洗脱系统（25 min，16%A）。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品0.2750 g，置于50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇定容，用5 mL移液管吸取3 mL，加入50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇定容，即得0.33 mg/mL的对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取当归饮片粉末、当归配方颗粒各0.5 g，置容量瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，超声处理（功率400 W，频率40 kHz） 30 min，过滤定容，低温贮存。上样前用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得供试品溶液。
2.1.4 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，进样10 μL，记录色谱图，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得阿魏酸回归方程为Y=25.387 9X-41.280 0（r=0.9998，n=5），结果表明，阿魏酸在0.033～0.165 μg范围内有良好的线性关系。
2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，分别测定6次，阿魏酸峰面积的RSD=1.05%（n=6），结果表明精密度良好。
2.1.6 重复性试验 按“2.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，各吸取10 μL进样测定，测得阿魏酸RSD=0.92%（n=6），结果表明重复性良好。
2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0、6、12、24、36、72 h各进样10 μL，测定峰面积积分值，RSD=1.17%（n=6），结果表明稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的样品共5份，分别加入一定量的阿魏酸对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液5份，进样量10 μL测定，结果阿魏酸的平均回收率为98.78%，RSD=0.99%（n=5），表明本法回收率良好。结果见表1。
2.2 水分测定
按照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅸ H水分测定法第一法测定。精密称定当归配方颗粒和饮片粉末20.710 6、25.241 2 g，置于圆底烧瓶中，加甲苯200 mL（自冷凝管顶端加入），将圆底烧瓶置电热套中缓缓加热，待甲苯开始沸腾时，调节温度，使每秒馏出2滴，待水分完全馏出，不再增加，将冷凝管内部用甲苯冲洗，继续蒸馏5 min，放冷至常温，拆卸装置，若二层管壁有水滴，可用蘸有甲苯的铜丝推下，放置使水和甲苯分离，检测水量。结果见表2。 2.3 浸出物含量测定
照水溶性和醇溶性浸出物测定法项下热浸法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅩⅤ]测定。取供试品约2.5 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加水或70%乙醇80 mL，密塞，称定质量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再次称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却，迅速精密称定质量。以干燥品计算供试品中水溶性及醇溶性浸出物的含量（%）。结果见表3。
2.4 样品含量测定
按“2.1.3”项下方法，以不同浓度甲醇和乙醇为溶剂、不同超声处理时间，分别制备当归饮片、当归配方颗粒供试品溶液，进样10 μL测定，结果见表4。色谱图见图1。
3 讨论
在色谱条件方面，对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸（pH=3）不同洗脱系统梯度洗脱进行了考察。用甲醇-水和乙腈-水梯度洗脱系统对同一样品进行分析，结果甲醇-水梯度洗脱基线漂移较重，色谱峰宽，峰形不好，出峰数目少，乙腈-水梯度洗脱系统更好。用乙腈-水与乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱系统对同一样品进行分析，乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱吸收峰数目多，峰形好，优于乙腈-水梯度洗脱系统。故选用乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱。取供试品溶液，分别于254、270、280、316、322 nm处检测，结果254、270 nm处有倒峰，316、322、280 nm处峰形较好，316 nm处出峰数目最多且有最大吸收，各峰响应值较高，基线稳定，故选用。另外，本研究所采用的HPLC方法不同于2010年版《中华人民共和国药典》，药典采用乙腈-0.085%磷酸梯度洗脱，其色谱图干扰峰、分离度及峰形均不如本文方法。
在提取方法上，本试验通过不同种类和浓度溶剂 （70%甲醇、75%甲醇、80%甲醇、70%乙醇）、提取时间（超声提取30、40 min），优选当归配方颗粒最佳提取工艺，结果70%甲醇超声30 min效果较好，提取率较高，能有效提取出当归中的阿魏酸，并且提取时间短。方法学考察表明，本法线性良好，精密度、稳定性好和重复性符合规定，可以作为当归配方颗粒中阿魏酸含量的测定方法，为科学、有效控制其质量提供了依据。
当归配方颗粒的各项含量指标均符合药典中当归的指标要求，阿魏酸含量均高于药典规定的0.05%。同时，采用同样方法测定当归饮片中阿魏酸的含量，其含量低于当归配方颗粒，表明当归配方颗粒从化学成分分析角度优于当归饮片。本试验为当归配方颗粒进一步研究奠定了基础。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：124.
[2] 贺亚玲，车晓彦，姜卫东，等.高效液相法测定当归配颗粒中阿魏酸含量[J].药物鉴定，2006，15（3）：39-43.
[3] 唐力英，王祝举，赫炎，等.高效液相色谱法测定当归中阿魏酸的含量[J].中国实验方剂学杂志，2006，12（2）：78-81.
[4] 邓丽琴.HPLC法测定当归配方颗粒中阿魏酸的含量研究[J].中医药导报，2005，18（8）：125-128.
[5] 刘伟，王洋.HPLC法测定当归片中阿魏酸的含量[J].黑龙江医药， 2011，11（1）：68-71.
[6] 王婕，赵建邦，宋平顺.30批当归中阿魏酸、藁本内酯含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（8）：70-72.
（收稿日期：2013-07-17，编辑：陈静）
关键词：当归配方颗粒；当归饮片；阿魏酸；高效液相色谱法
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0070-03
当归是伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.）Diels的干燥根，始载于《神农本草经》，列为上品。当归味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，主要功效为补血活血、调经止痛、润肠通便，广泛应用于临床各科[1]。当归配方颗粒由当归单味药加工制成，其性味、归经、功效与原饮片基本一致，用于中医临床配方，既可满足临床辨证论治、随证加减的需要，又具有免煎易服、作用迅速、安全卫生和携带方便等优点，具有很好的应用前景[2-3]。
当归主要含有挥发油、有机酸、生物碱、酚类等多种成分[4]，有机酸中的阿魏酸为水溶性有效成分，因其可溶于水、醇、醋酸乙酯等溶剂，在制剂中容易被提取出来，但也易被各种因素（氧化、水解）破坏[5]，阿魏酸是公认的天然抗氧化剂，也是近年来国际认的防癌物质，与藁本内酯一同被认为是当归药理作用的主要物质基础[6]，故可通过测定阿魏酸含量来评价当归的质量。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）测定当归配方颗粒和饮片中的阿魏酸含量，并测定水分和浸出物含量，考察当归配方颗粒的质量。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（Aglient液相色谱仪1200），电热风干燥器（中国重庆试验设备制造，CS101-1），气流烘干器（河南省巩义市甘埔仪器厂，B-20头），分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，BS2245），超声清洗机（上海新苗医疗器械厂，B*7200HP），万能粉碎机（北京利伟永兴仪器有限公司，FW-400A）。
阿魏酸对照品（纯度>98%，中国药品生物制品检定所，批号1100-201112）；当归饮片（购于兰州惠仁堂，产地：岷县，批号1112041M），经甘肃中医学院药学系生药教研室李成义教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；当归配方颗粒（广东一方制药有限公司，批号1201021）。无水乙醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司），水（娃哈哈纯净水），乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司），甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司），磷酸（优级纯，北京益利精细化学品有限公司）。
2 方法与结果
2.1 阿魏酸含量测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min，检测波长：316 nm；柱温：28 ℃；流动相：乙腈（A）- 0.05%磷酸水（B）梯度洗脱系统（25 min，16%A）。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品0.2750 g，置于50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇定容，用5 mL移液管吸取3 mL，加入50 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇定容，即得0.33 mg/mL的对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取当归饮片粉末、当归配方颗粒各0.5 g，置容量瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，超声处理（功率400 W，频率40 kHz） 30 min，过滤定容，低温贮存。上样前用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得供试品溶液。
2.1.4 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，进样10 μL，记录色谱图，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得阿魏酸回归方程为Y=25.387 9X-41.280 0（r=0.9998，n=5），结果表明，阿魏酸在0.033～0.165 μg范围内有良好的线性关系。
2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，分别测定6次，阿魏酸峰面积的RSD=1.05%（n=6），结果表明精密度良好。
2.1.6 重复性试验 按“2.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，各吸取10 μL进样测定，测得阿魏酸RSD=0.92%（n=6），结果表明重复性良好。
2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0、6、12、24、36、72 h各进样10 μL，测定峰面积积分值，RSD=1.17%（n=6），结果表明稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的样品共5份，分别加入一定量的阿魏酸对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液5份，进样量10 μL测定，结果阿魏酸的平均回收率为98.78%，RSD=0.99%（n=5），表明本法回收率良好。结果见表1。
2.2 水分测定
按照2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录Ⅸ H水分测定法第一法测定。精密称定当归配方颗粒和饮片粉末20.710 6、25.241 2 g，置于圆底烧瓶中，加甲苯200 mL（自冷凝管顶端加入），将圆底烧瓶置电热套中缓缓加热，待甲苯开始沸腾时，调节温度，使每秒馏出2滴，待水分完全馏出，不再增加，将冷凝管内部用甲苯冲洗，继续蒸馏5 min，放冷至常温，拆卸装置，若二层管壁有水滴，可用蘸有甲苯的铜丝推下，放置使水和甲苯分离，检测水量。结果见表2。 2.3 浸出物含量测定
照水溶性和醇溶性浸出物测定法项下热浸法[2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录ⅩⅤ]测定。取供试品约2.5 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加水或70%乙醇80 mL，密塞，称定质量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再次称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却，迅速精密称定质量。以干燥品计算供试品中水溶性及醇溶性浸出物的含量（%）。结果见表3。
2.4 样品含量测定
按“2.1.3”项下方法，以不同浓度甲醇和乙醇为溶剂、不同超声处理时间，分别制备当归饮片、当归配方颗粒供试品溶液，进样10 μL测定，结果见表4。色谱图见图1。
3 讨论
在色谱条件方面，对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸（pH=3）不同洗脱系统梯度洗脱进行了考察。用甲醇-水和乙腈-水梯度洗脱系统对同一样品进行分析，结果甲醇-水梯度洗脱基线漂移较重，色谱峰宽，峰形不好，出峰数目少，乙腈-水梯度洗脱系统更好。用乙腈-水与乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱系统对同一样品进行分析，乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱吸收峰数目多，峰形好，优于乙腈-水梯度洗脱系统。故选用乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱。取供试品溶液，分别于254、270、280、316、322 nm处检测，结果254、270 nm处有倒峰，316、322、280 nm处峰形较好，316 nm处出峰数目最多且有最大吸收，各峰响应值较高，基线稳定，故选用。另外，本研究所采用的HPLC方法不同于2010年版《中华人民共和国药典》，药典采用乙腈-0.085%磷酸梯度洗脱，其色谱图干扰峰、分离度及峰形均不如本文方法。
在提取方法上，本试验通过不同种类和浓度溶剂 （70%甲醇、75%甲醇、80%甲醇、70%乙醇）、提取时间（超声提取30、40 min），优选当归配方颗粒最佳提取工艺，结果70%甲醇超声30 min效果较好，提取率较高，能有效提取出当归中的阿魏酸，并且提取时间短。方法学考察表明，本法线性良好，精密度、稳定性好和重复性符合规定，可以作为当归配方颗粒中阿魏酸含量的测定方法，为科学、有效控制其质量提供了依据。
当归配方颗粒的各项含量指标均符合药典中当归的指标要求，阿魏酸含量均高于药典规定的0.05%。同时，采用同样方法测定当归饮片中阿魏酸的含量，其含量低于当归配方颗粒，表明当归配方颗粒从化学成分分析角度优于当归饮片。本试验为当归配方颗粒进一步研究奠定了基础。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：124.
[2] 贺亚玲，车晓彦，姜卫东，等.高效液相法测定当归配颗粒中阿魏酸含量[J].药物鉴定，2006，15（3）：39-43.
[3] 唐力英，王祝举，赫炎，等.高效液相色谱法测定当归中阿魏酸的含量[J].中国实验方剂学杂志，2006，12（2）：78-81.
[4] 邓丽琴.HPLC法测定当归配方颗粒中阿魏酸的含量研究[J].中医药导报，2005，18（8）：125-128.
[5] 刘伟，王洋.HPLC法测定当归片中阿魏酸的含量[J].黑龙江医药， 2011，11（1）：68-71.
[6] 王婕，赵建邦，宋平顺.30批当归中阿魏酸、藁本内酯含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（8）：70-72.
（收稿日期：2013-07-17，编辑：陈静）