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摘要：目的 观察舒郁散对慢性应激抑郁大鼠的行为变化、脑组织肿瘤坏死因子（TNF-α）含量及海马神经肽表达的影响，为临床治疗提供实验依据。方法 50只大鼠随机分为正常组、模型组、盐酸氟西汀组及舒郁散小、大剂量组，各治疗组给予相应药物，正常组与模型组给予等容积蒸馏水。应激刺激造模，采用糖水消耗实验、悬尾实验观察大鼠行为改变，采用ELISA检测脑组织TNF-α含量，免疫组化法观察大鼠海马神经肽表达。结果 盐酸氟西汀、舒郁散大剂量组大鼠悬尾不动时间明显减少，糖水消耗量明显增加，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。盐酸氟西汀、舒郁散大剂量组大鼠脑组织TNF-α含量显著降低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。盐酸氟西汀组、舒郁散大剂量组海马神经肽免疫反应阳性神经元数目减少，平均光密度降低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论 舒郁散具有抗抑郁作用，其作用与剂量呈正相关。
关键词：舒郁散；抑郁症；动物行为；肿瘤坏死因子-α；神经肽；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0046-03
抑郁症是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的临床综合征，抑郁症患者存在与应激紧密相关的炎性应答和氧化应激过度激活现象，表现为肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量增高[1]。海马为大脑边缘系统的重要组成部分，海马与许多高级神经活动行为反应以及植物性神经功能密切相关，应激能引起神经肽分泌，神经肽的抗应激作用明显超过其他内源性化合物[2]。舒郁散具有疏肝理气、养心安神解郁之功效，可改善抑郁患者的临床症状；能调节抑郁大鼠脑神经递质及海马5-羟色胺受体表达而发挥抗抑郁的作用[3]。本研究观察舒郁散对慢性不可预见性应激（CMUS）抑郁大鼠行为、脑组织TNF-α含量及海马神经肽表达的影响，为临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
50只SPF级Wister大鼠，中国人民解放军总医院医学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（京） 2011-0005，体质量180～220 g。
1.2 药物
舒郁散由酸枣仁、郁金、栀子、五味子、炙麻黄组成，上药浸泡、煎煮，过滤，于80 ℃恒温水浴中浓缩成含原药材量5 g/mL药液，存冰箱备用，使用时用蒸馏水稀释灌胃；盐酸氟西汀片，礼来苏州制药有限公司分装，批号3021A。
1.3 试剂与仪器
TNF-α放免试剂盒，中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所生产；神经肽多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号990901W），二抗显色试剂盒：EnVision Detection Kit，基因科技（上海）有限公司产品（Code No.GK500705）。全自动真空脱水机（LEICAASP300）、组织包埋机（LEICA EG1140H）、石蜡切片机（LEICA RM2135）、展片机（LEICA HI1210），德国LEICA公司；光学显微镜，日本OLYMPUS BX60系统显微镜；酶标仪THERMO MultiskanMK3（美国）。Image-proplus 5.1显微图像分析系统。
1.4 分组与给药
实验大鼠随机分为正常组、模型组、盐酸氟西汀组和舒郁散小（0.5 g/mL）、大（5.0 g/mL）剂量组，每组10只。盐酸氟西汀组每日灌服盐酸氟西汀药液1.8 mg/kg，相当于70 kg成人常规临床用药的等效量；舒郁散小、大剂量组给予相应舒郁散灌胃，每次1 mL，正常组和模型给予等容积蒸馏水灌胃，连续21 d。正常组每笼饲养5只，其他组每笼饲养1只。
1.5 造模
大鼠进行21 d应激刺激，包括摇晃5 min，禁水24 h、禁食24 h，夹尾1 min，电击足底（每次10 s，间隔1 min，共计30次），冰水游泳5 min，噪音刺激，转换昼夜节律24 h，制动，热刺激40 ℃、5 min，每日刺激1次，每次平均接受2种刺激[4]。
1.6 动物行为学检测
悬尾实验（TST）参照Steru[5]方法，将大鼠尾端4 cm的部位固定在一根水平木棍上，使大鼠呈倒挂状态，其头部离水平面5～6 cm，用木板隔开相邻大鼠的视线，记录每只大鼠在5 min内不动时间；实验后用酒精清除箱内上一只大鼠留下的残留物和气味，防止对其他大鼠行为造成影响。糖水消耗实验（SPT）：实验前给大鼠正常的水和食物供应，实验开始时移去所有食物和水，将大鼠单独成笼，每个笼子中央紧靠着放体积相同的1%蔗糖水和自来水各1杯，在5 h内让大鼠自由摄水。为了防止大鼠对某侧的蔗糖水或自来水形成特殊的偏好，5 h后交换蔗糖水和自来水的位置。再经过5 h后，测量大鼠摄入蔗糖水和自来水的量，计算摄入蔗糖水百分比[蔗糖水量/（蔗糖水量+自来水量）×100%]。
1.7 肿瘤坏死因子-α含量与海马神经肽免疫组化检测
行为实验结束后处死大鼠，断头冰面上迅速取脑，分离大脑皮层，生理盐水冲洗，称重、制备成10%组织匀浆，-70 ℃冰箱中保存，按说明书行脑组织TNF-α含量测定。参照大鼠脑立体定位图谱[6]，取海马、脱水、包埋，置于APES防脱玻片上。60 ℃烤片4 h，常规脱蜡、脱水、浸洗；3%H2O2 10 min，PBS浸洗 2 min，共3次，浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液。微波热修复后，滴加一抗神经肽多克隆抗体（1∶200），4 ℃冰箱孵育过夜，室温复温30 min后PBS浸洗5 min，共3次，再滴加非生物素二抗，湿盒中室温30 min，PBS 浸洗5 min，共3次，DAB显色光镜下控制时间，脱水、透明、封片。采用Image Pro plus5.1图像分析系统测定每张照片的阳性细胞。 1.8 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件进行分析。所有数据均用—x±s表示，进行正态性检验，多个样本均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠尾悬实验与糖水消耗实验检测结果
与正常组比较，模型组大鼠TST悬尾不动时间明显延长，摄入蔗糖水百分率明显下降（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，盐酸氟西汀组、舒郁散大剂量组大鼠悬尾不动时间明显减少，摄入蔗糖水百分率显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 舒郁散对大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α含量与海马神经肽表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠脑组织TNF-α含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，舒郁散大剂量组、盐酸氟西汀组脑组织TNF-α含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。海马神经肽阳性反应主要存在于细胞胞浆内，呈深棕色、胞核阴性；模型组大鼠海马区神经肽免疫反应阳性神经数目减少，细胞形态不规则，间隙增大，排列疏松不齐，颜色模糊，表达明显减弱，平均光密度值明显升高，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，盐酸氟西汀组、舒郁散大剂量组大鼠海马区神经肽表达明显增强，平均光密度值明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
现代医学对于抑郁症的发病机制的研究很多，关于抑郁症发病机制的认识主要包括神经内分泌、单胺类神经递质、脂质过氧化、免疫功能异常等，研究主要涉及神经生化机制、神经内分泌机制、免疫调节机制等方面。大脑的海马区作为边缘系统的重要组成部分，对情绪、学习、记忆、行为等有重要的调节作用，成为备受关注的脑区[7]。无论是抑郁症患者，还是行为性抑郁的动物模型，均有海马形态结构和分子生物学改变的报道，海马富含各种神经递质及受体，是参与应激反应的最重要脑区之一，也是易造成应激损伤的主要靶器官[8]。神经肽广泛分布于中枢神经系统，在大脑皮质、海马、丘脑等部位浓度较高，作为一种神经递质，神经肽与去甲肾上腺素、肾上腺素、γ-氨基丁酸等经典神经递质共存，参与摄食、情感调节和学习记忆等活动，与抑郁症密切相关，应激能引起神经肽分泌，神经肽的抗应激作用明显超过了其他内源性化合物[9]。CMUS在实验中被用于模拟抑郁症的核心症状，如兴趣缺失、绝望行为、睡眠障碍等，是目前广泛应用的经典抑郁模型之一，用于抗抑郁新药的筛选、临床作用机制及抑郁症病理生理机制的研究[10]。兴趣缺失是抑郁症的核心症状之一，而TST可以反映大鼠的快感缺失状态，糖水消耗量降低提示大鼠对奖赏的反应性下降，是一种特异性的快感缺乏的表现。本研究采用CUMS建立大鼠抑郁模型，选择悬尾和糖水偏好这两个经典的行为学实验检测抑郁大鼠的兴趣缺失等行为障碍。结果表明，大剂量舒郁散可以减少CUMS大鼠悬尾不动时间、增加糖水消耗量，具有抗抑郁作用。大剂量舒郁散能降低CUMS大鼠脑组织TNF-α水平，增强大鼠海马区神经肽表达。
舒郁散由酸枣仁、郁金、栀子等药物组成，具有调理心肝、疏肝理气、养心解郁之功效，对抑郁症的治疗具有较好疗效[11]。本研究仅观察舒郁散对慢性应激抑郁大鼠脑组织TNF-α含量以及海马神经肽表达的影响。抑郁症的发病机理较为复杂，有关舒郁散抗抑郁作用机理还有待进一步的研究。
参考文献：
[1] Miller GE， Rohleder N， Stetler C， et al. Clinical depression and regulation of the inflammatory response during acute stress[J]. Psychosomatic Med，2005，67（5）：679-687.
[2] Bratt AM， Kelley SP， Knowles JP， et al. Long term modulation of the HPA axis by the hippocampus：Behavioral， biochemical and immunological endpoints in rats exposed to chronic mild stress[J]. Psychoneuroendocrinology，2001，26（2）：121–145.
[3] Liping Chen， Mengli Chen， Fawei Wang， et al. Antidepressant-like effect of Shuyusan in rats exposed to chronic stress：effects on hypothalamic-pituitary-adrenal function[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2012，Article ID 940846.
[4] Katz RJ， Roth KA， Carroll BJ. Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat：implications for a model of depression[J]. Neuroscience Biobehavioral Reviews，1981，20（5）：247.
[5] Steru L， Chermat R， Thierry B. The tail suspension test：A new method for screening antidepressants in mice[J]. Psycho- pharmacology，1985，85（3）：367-370.
[6] 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京：人民卫生出版社， 1991：38-56.
[7] 马允香.抑郁症神经生物学机制研究进展[J].河北医科大学学报， 2006，27（6）：594-596.
[8] 洪伟.抑郁症与血神经肽Y水平的关系[J].中国临床康复，2004，8（9）：1698-1700.
[9] Ishida H， Shirayama Y， Iwata M， et al Infusion of neuropeptide Y into CA3 region of hippocampus produces antidepressant-like effect via Y1 receptor[J]. Hippocampus，2007，30（7）：615-624.
[10] 吕俊华，钟玲.实验性抑郁症动物模型的评价[J].中国病理生理杂志， 2001，17（9）：916-919.
[11] 孙志高，黄泉智，冯杰，等.舒郁散治疗抑郁症临床研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19（12）：7-9.
（收稿日期：2013-09-13，编辑：华强）
关键词：舒郁散；抑郁症；动物行为；肿瘤坏死因子-α；神经肽；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0046-03
抑郁症是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的临床综合征，抑郁症患者存在与应激紧密相关的炎性应答和氧化应激过度激活现象，表现为肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量增高[1]。海马为大脑边缘系统的重要组成部分，海马与许多高级神经活动行为反应以及植物性神经功能密切相关，应激能引起神经肽分泌，神经肽的抗应激作用明显超过其他内源性化合物[2]。舒郁散具有疏肝理气、养心安神解郁之功效，可改善抑郁患者的临床症状；能调节抑郁大鼠脑神经递质及海马5-羟色胺受体表达而发挥抗抑郁的作用[3]。本研究观察舒郁散对慢性不可预见性应激（CMUS）抑郁大鼠行为、脑组织TNF-α含量及海马神经肽表达的影响，为临床治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
50只SPF级Wister大鼠，中国人民解放军总医院医学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（京） 2011-0005，体质量180～220 g。
1.2 药物
舒郁散由酸枣仁、郁金、栀子、五味子、炙麻黄组成，上药浸泡、煎煮，过滤，于80 ℃恒温水浴中浓缩成含原药材量5 g/mL药液，存冰箱备用，使用时用蒸馏水稀释灌胃；盐酸氟西汀片，礼来苏州制药有限公司分装，批号3021A。
1.3 试剂与仪器
TNF-α放免试剂盒，中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所生产；神经肽多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号990901W），二抗显色试剂盒：EnVision Detection Kit，基因科技（上海）有限公司产品（Code No.GK500705）。全自动真空脱水机（LEICAASP300）、组织包埋机（LEICA EG1140H）、石蜡切片机（LEICA RM2135）、展片机（LEICA HI1210），德国LEICA公司；光学显微镜，日本OLYMPUS BX60系统显微镜；酶标仪THERMO MultiskanMK3（美国）。Image-proplus 5.1显微图像分析系统。
1.4 分组与给药
实验大鼠随机分为正常组、模型组、盐酸氟西汀组和舒郁散小（0.5 g/mL）、大（5.0 g/mL）剂量组，每组10只。盐酸氟西汀组每日灌服盐酸氟西汀药液1.8 mg/kg，相当于70 kg成人常规临床用药的等效量；舒郁散小、大剂量组给予相应舒郁散灌胃，每次1 mL，正常组和模型给予等容积蒸馏水灌胃，连续21 d。正常组每笼饲养5只，其他组每笼饲养1只。
1.5 造模
大鼠进行21 d应激刺激，包括摇晃5 min，禁水24 h、禁食24 h，夹尾1 min，电击足底（每次10 s，间隔1 min，共计30次），冰水游泳5 min，噪音刺激，转换昼夜节律24 h，制动，热刺激40 ℃、5 min，每日刺激1次，每次平均接受2种刺激[4]。
1.6 动物行为学检测
悬尾实验（TST）参照Steru[5]方法，将大鼠尾端4 cm的部位固定在一根水平木棍上，使大鼠呈倒挂状态，其头部离水平面5～6 cm，用木板隔开相邻大鼠的视线，记录每只大鼠在5 min内不动时间；实验后用酒精清除箱内上一只大鼠留下的残留物和气味，防止对其他大鼠行为造成影响。糖水消耗实验（SPT）：实验前给大鼠正常的水和食物供应，实验开始时移去所有食物和水，将大鼠单独成笼，每个笼子中央紧靠着放体积相同的1%蔗糖水和自来水各1杯，在5 h内让大鼠自由摄水。为了防止大鼠对某侧的蔗糖水或自来水形成特殊的偏好，5 h后交换蔗糖水和自来水的位置。再经过5 h后，测量大鼠摄入蔗糖水和自来水的量，计算摄入蔗糖水百分比[蔗糖水量/（蔗糖水量+自来水量）×100%]。
1.7 肿瘤坏死因子-α含量与海马神经肽免疫组化检测
行为实验结束后处死大鼠，断头冰面上迅速取脑，分离大脑皮层，生理盐水冲洗，称重、制备成10%组织匀浆，-70 ℃冰箱中保存，按说明书行脑组织TNF-α含量测定。参照大鼠脑立体定位图谱[6]，取海马、脱水、包埋，置于APES防脱玻片上。60 ℃烤片4 h，常规脱蜡、脱水、浸洗；3%H2O2 10 min，PBS浸洗 2 min，共3次，浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液。微波热修复后，滴加一抗神经肽多克隆抗体（1∶200），4 ℃冰箱孵育过夜，室温复温30 min后PBS浸洗5 min，共3次，再滴加非生物素二抗，湿盒中室温30 min，PBS 浸洗5 min，共3次，DAB显色光镜下控制时间，脱水、透明、封片。采用Image Pro plus5.1图像分析系统测定每张照片的阳性细胞。 1.8 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件进行分析。所有数据均用—x±s表示，进行正态性检验，多个样本均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠尾悬实验与糖水消耗实验检测结果
与正常组比较，模型组大鼠TST悬尾不动时间明显延长，摄入蔗糖水百分率明显下降（P<0.01），说明造模成功。与模型组比较，盐酸氟西汀组、舒郁散大剂量组大鼠悬尾不动时间明显减少，摄入蔗糖水百分率显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 舒郁散对大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α含量与海马神经肽表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠脑组织TNF-α含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，舒郁散大剂量组、盐酸氟西汀组脑组织TNF-α含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。海马神经肽阳性反应主要存在于细胞胞浆内，呈深棕色、胞核阴性；模型组大鼠海马区神经肽免疫反应阳性神经数目减少，细胞形态不规则，间隙增大，排列疏松不齐，颜色模糊，表达明显减弱，平均光密度值明显升高，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，盐酸氟西汀组、舒郁散大剂量组大鼠海马区神经肽表达明显增强，平均光密度值明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
现代医学对于抑郁症的发病机制的研究很多，关于抑郁症发病机制的认识主要包括神经内分泌、单胺类神经递质、脂质过氧化、免疫功能异常等，研究主要涉及神经生化机制、神经内分泌机制、免疫调节机制等方面。大脑的海马区作为边缘系统的重要组成部分，对情绪、学习、记忆、行为等有重要的调节作用，成为备受关注的脑区[7]。无论是抑郁症患者，还是行为性抑郁的动物模型，均有海马形态结构和分子生物学改变的报道，海马富含各种神经递质及受体，是参与应激反应的最重要脑区之一，也是易造成应激损伤的主要靶器官[8]。神经肽广泛分布于中枢神经系统，在大脑皮质、海马、丘脑等部位浓度较高，作为一种神经递质，神经肽与去甲肾上腺素、肾上腺素、γ-氨基丁酸等经典神经递质共存，参与摄食、情感调节和学习记忆等活动，与抑郁症密切相关，应激能引起神经肽分泌，神经肽的抗应激作用明显超过了其他内源性化合物[9]。CMUS在实验中被用于模拟抑郁症的核心症状，如兴趣缺失、绝望行为、睡眠障碍等，是目前广泛应用的经典抑郁模型之一，用于抗抑郁新药的筛选、临床作用机制及抑郁症病理生理机制的研究[10]。兴趣缺失是抑郁症的核心症状之一，而TST可以反映大鼠的快感缺失状态，糖水消耗量降低提示大鼠对奖赏的反应性下降，是一种特异性的快感缺乏的表现。本研究采用CUMS建立大鼠抑郁模型，选择悬尾和糖水偏好这两个经典的行为学实验检测抑郁大鼠的兴趣缺失等行为障碍。结果表明，大剂量舒郁散可以减少CUMS大鼠悬尾不动时间、增加糖水消耗量，具有抗抑郁作用。大剂量舒郁散能降低CUMS大鼠脑组织TNF-α水平，增强大鼠海马区神经肽表达。
舒郁散由酸枣仁、郁金、栀子等药物组成，具有调理心肝、疏肝理气、养心解郁之功效，对抑郁症的治疗具有较好疗效[11]。本研究仅观察舒郁散对慢性应激抑郁大鼠脑组织TNF-α含量以及海马神经肽表达的影响。抑郁症的发病机理较为复杂，有关舒郁散抗抑郁作用机理还有待进一步的研究。
参考文献：
[1] Miller GE， Rohleder N， Stetler C， et al. Clinical depression and regulation of the inflammatory response during acute stress[J]. Psychosomatic Med，2005，67（5）：679-687.
[2] Bratt AM， Kelley SP， Knowles JP， et al. Long term modulation of the HPA axis by the hippocampus：Behavioral， biochemical and immunological endpoints in rats exposed to chronic mild stress[J]. Psychoneuroendocrinology，2001，26（2）：121–145.
[3] Liping Chen， Mengli Chen， Fawei Wang， et al. Antidepressant-like effect of Shuyusan in rats exposed to chronic stress：effects on hypothalamic-pituitary-adrenal function[J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2012，Article ID 940846.
[4] Katz RJ， Roth KA， Carroll BJ. Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat：implications for a model of depression[J]. Neuroscience Biobehavioral Reviews，1981，20（5）：247.
[5] Steru L， Chermat R， Thierry B. The tail suspension test：A new method for screening antidepressants in mice[J]. Psycho- pharmacology，1985，85（3）：367-370.
[6] 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京：人民卫生出版社， 1991：38-56.
[7] 马允香.抑郁症神经生物学机制研究进展[J].河北医科大学学报， 2006，27（6）：594-596.
[8] 洪伟.抑郁症与血神经肽Y水平的关系[J].中国临床康复，2004，8（9）：1698-1700.
[9] Ishida H， Shirayama Y， Iwata M， et al Infusion of neuropeptide Y into CA3 region of hippocampus produces antidepressant-like effect via Y1 receptor[J]. Hippocampus，2007，30（7）：615-624.
[10] 吕俊华，钟玲.实验性抑郁症动物模型的评价[J].中国病理生理杂志， 2001，17（9）：916-919.
[11] 孙志高，黄泉智，冯杰，等.舒郁散治疗抑郁症临床研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19（12）：7-9.
（收稿日期：2013-09-13，编辑：华强）