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摘要：目的： 研究各月經周期卵巢巧克力囊肿（巧囊）异位内膜腺上皮和间质细胞中孕激素亚受体A、B（PRA，PRB）和17β-羟甾类固醇脱氢酶Ⅱ（17β-HSD2）的表达变化，并探讨其与异位灶孕激素抵抗的关系。方法： 采用免疫组化和RT-PCR技术检测45例巧囊和35例正常对照组子宫内膜组织（对照组）孕激素受体（A+B）（PR）、PRA，PRB蛋白和17β-HSD2mRNA的表达。结果： （1）正常对照组分泌期内膜均有17β-HSD2 mRNA的表达，而巧囊组均无表达；（2）巧囊壁异位腺上皮中PRA、PRB、PR（A+B）蛋白表达少于正常（P﹤0.01）；间质中PRB蛋白表达显著高于正常（P﹤0.01），间质中PRA、PR（A+B）蛋白表达与对照组无统计学差异（P﹥0.05）；异位腺体和间质中PRB/PRA明显高于正常（P﹤0.01），且PRA、PRB、PR蛋白表达均无周期性改变。结论： 巧囊壁异位细胞中孕激素亚受体PRB、PRA及其比值改变可能使内异灶局部孕激素抵抗，不能诱导17β-HSD2表达，致局部雌激素积聚，异位腺上皮生长，在EMS发病中起到始发作用。
关键词：卵巢子宫内膜异位症；17β-羟甾类固醇脱氢酶Ⅱ；孕激素受体，孕激素；
Abstract： Objective To study the correlation between progestin resistance and the expression of progesterone receptor subtypes in the epithelial and stromal cells and 17-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 （17β-HSD2） throughout the menstrual cycle of human ovarian endometriosis. Methods PT-PCR was used to assess 17β-HSD2 messenger RNA（mRNA） expression of 45 ovarian endometriosis and 35 normal eutopic endometrium throughout the menstrual cycle； immunohistochemical assay was performed to examin the protein expression of PRA， PRB and PRAB（PRA+PRB） in the above cases. Results （1） In all ovarian endometriosis， 17β-HSD2 mRNA could not be checked， however， in normal eutopic endometrium， the expression of 17β-HSD2 mRNA during the secretory phase was positive. （2）In the glandular epithelium of ovarian endometriosis， the expression of PRB， PRA and PR（A+B） protein was statistically significantly lower than that in the normal endometrium（P<0.01）， in the stromal cells of ovarian endometriosis，the expression of PRB was statistically significantly higher than that in the normal endometrium（P<0.01）. But the expression of PRA and PR（A+B） protein shows no difference in the normal endometrium（P﹥0.05）. In ovarian endometriosis， the expression of PRB、PRA and PR（A+B） protein has no cyclic variation throughout the cycle， the ratio of PRB / PRA in the glandular epithelium and stromal cells was significantly higher than that in normal endometrium（P﹤0.01）. Conclusion The abnormal expression of stomal progesterone receptor B， A in ovarian endometriosis ， which may be responsible for the local progestin resistance， fail to induce the expression of 17β-HSD2 and up-regulate the local estrogen concentration in endometriosis. Thus high estrogen level in endometriosis promoted the growth of ectopic epithelial cells. the present results suggested endometriotic stroma probably plays a primordial role in the development and growth of endometriosis.
keywords：17-hydroxysteroid dehydrogenase type 2； progesterone receptor ；； progestin； ovarian endometriosis 子宫内膜异位症（EMS）是一种雌激素依赖性疾病，雌二醇（E2）是异位内膜生长强有丝分裂原，正常子宫内膜孕激素与孕激素受体（PR）作用后通过部分拮抗E2抑制异位内膜的生长，17β-羟甾类固醇脱氢酶Ⅱ（17β-HSD2）是E2氧化酶，也能降解E2为活性低的雌酮（E1）。已有研究表明EMS异位上皮无17β-HSD2表达；临床上用孕激素治疗EMS，50%的患者无效且易复发；Shaw【1】研究发现 EMS患者内异灶局部及增生期腹腔液中孕激素水平比正常人高，高水平的孕激素不但未能拮抗E2，还促进异位灶生长，17β-HSD2由孕激素与内膜间质细胞中的PR作用诱导并激活，这些孕激素抵抗现象都说明异位灶PR功能可能缺陷。既往研究认为异位间质细胞中的PR表达与正常内膜无差异，故本研究提出假设：异位内膜组织的异位腺体或间质细胞中PR亚型分布及量的改变可能是局部孕激素抵抗原因之一。我们用免疫组化检测巧囊异位腺上皮和间质细胞中PRA、PRB表达，以探讨其改变与孕激素抵抗的关系。
1 材料和方法
1.1研究对象 巧囊组：2003年10月至2004年12月在福建医科大学附属第一医院及福建省妇幼保健院行腹腔镜或开腹手术获70例标本，实验前用HE染色行组织病理学鉴定，镜下可见异位腺上皮和间质细胞者纳入试验组，共45例；正常对照组：取35例未经放、化疗治疗的宫颈癌Ia患者的子宫内膜标本为对照组。以上两组患者均为已婚，至少术前三个月未用任何激素类药物治疗，有正常的月经周期（26-31天），年龄（29±5）岁 （23岁～40岁）。对照组正常内膜月经期别根据其月经周期和Noye’s分期标准来证实其确切的组织形态学分期。
1.2试剂来源： RT-PCR试剂：一步法RNA提取试剂TRIZOL购自美国Promeger公司；RT-PCR反转录试剂盒购自MBI公司，Taq酶购自上海博亚生物公司。免疫组化试剂：鼠抗人PR（A+B） 单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人PRA和PRB单克隆抗体购自美国NeoMarkers公司；二抗为羊抗免疫球蛋白，购自美国DAKO公司。由于PR受体基因的特殊性，无法针对PRA设计出特异的抗体，但研究表明【2】本实验所选克隆型号为hPRa7的一抗特异性识别PRA， hPRa2型单克隆抗体特异性识别PRB。
1.3方法
1.3.1取材 刮取宫底和宫后壁的正常子宫内膜和取经开腹或腹腔镜手术确诊的巧囊壁，磷酸盐缓冲液冲洗标本3次，一部分标本离体后20min内取50mg新鲜组织，立即冻存于-72℃超低温冰箱中，2 hr内提取总RNA；一部分标本立即固定于4%多聚甲醛中，乙醇脱水、石蜡包埋、切片机连续切片。
1.3.2 17β-HSD2 mRNA表达水平（1）组织中总RNA的提取：用Trizol提取标本组织总RNA，严格按试剂盒说明书操作；（2）引物设计：17β-HSD2 引物序列 上游引物（F）5"-CGGTGCTCCAAATGGACATCAC-3' 下游引物（R）5'- GGATGGAAGCAACTTTAATTCCCC -3'，目的基因片断大小為384bp；内参序列：上游（F）5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3'，下游（R）5'-ATG TCACGCCACGATTTCCCG C -3'，扩增判断长度为500bp【3】。引物由上海生工合成。（3）逆转录：严格按照试剂盒说明书操作，逆转录合成cDNA，反应条件为42℃1h，70℃10min。（4）PCR扩增目的基因片断，以β-Actin为内参照。PCR反应条件：95℃预变性5min后，按照95℃30s、57℃30s、72℃30s反复进行35个循环，最后72℃延伸10min。（5）PCR产物分析：PCR产物经1.5%的琼脂凝胶电泳完毕后用密度扫描仪分析其光密度值，以17β-HSD2与β-actin吸光度比值来反应该基因mRNA的表达量。
1.3.3免疫组化检测及判断PR（A+B）、PRA、PRB蛋白表达水平 采用免疫组化两步法（LDP，labbled dextran polymer method）检测。由两位病理科医生采用双盲法判断试验结果。三种抗体均表达在腺上皮和间质细胞核内，阳性染色者在细胞核内有棕黄色颗粒沉着。判断标准如下【4】：选择具有代表性的异位腺上皮和间质细胞的10个高倍镜视野（×400）观察，并随机计数100个腺上皮或间质细胞，结果依染色的强弱和染色的百分比两项来评分判断。染色的强弱得分标准：弱表达为1分，中度表达为2分，强表达为3分，无表达为0分；半定量得分=∑阳性细胞染色强度×阳性细胞百分数。
1.3统计学处理
采用SPSS12.0统计软件进行统计分析。计量资料以X±s表示，组间和组内比较用LSD检验。P<0.05表明有统计学意义。
2 结果
2.1巧囊、正常内膜两组17β-HSD2 mRNA的表达
正常内膜组增生早中期无17β-HSD2mRNA表达；分泌晚期表达显著高于分泌早中期；巧囊组45例增生期和分泌期均无17β-HSD2mRNA的表达（见表1）。
表1两组子宫内膜中17β-HSDⅡmRNA的表达
﹡P<0.05 vs正常增生晚期和分泌早中期
图1：17β-HSD2mRNA在巧囊和对照组中的电泳图
1：Marker；2、3、4：增生期，分泌早期，分泌晚期对照组；5：巧囊组
2.2 正常子宫内膜腺上皮和间质细胞中PR（A+B）、PRA、PRB蛋白表达
PR（A+B）是总孕激素受体，包含PRA和PRB，观看连续切片的组化片，子宫内膜同一腺上皮和间质细胞中，同时表达PRA和PRB。增生期PRA、PRB表达无统计学差异；增生中晚期达高峰，自分泌早期始，PRA、PRB减少，分泌晚期几乎无表达。整个月经周期间质主要以PRA表达为主，PRB表达少，增生中晚期达高峰，至分泌晚期仍有散在的细胞表达PRA 2.3巧囊异位内膜腺上皮和间质细胞中PR（A+B）、PRA、PRB蛋白表达
异位腺上皮细胞中PR（A+B）表达少于正常对照组（P<0.01），PRB、PRA明显低于正常内膜，以PRA的减少为甚（P<0.01）；异位间质细胞PR（A+B）、PRA与正常内膜无差异（P>0.05），PRB显著高于正常内膜（P<0.01）；但异位腺上皮和间质细胞中PRB/PRA、PRB/PR（A+B）显著高于正常内膜；异位间质细胞中分泌晚期PRA、PRB表达与增生期、分泌早、中期无显著差异，且PR（A+B）、PRA、PRB的表达无周期性改变。
图2 间质细胞中PRA and PRB 蛋白表达
注：NE：正常对照组；OE：巧囊组；PP：增生期；ESP：分泌早期；LSP：分泌晚期
★P<0.01 vs晚分泌期的正常内膜
图3腺上皮细胞中PRA and PRB 蛋白表达
注：* P<0.01 vs增生期和分泌早期的正常内膜；△ P<0.05 vs增生期和分泌早期（）；★P<0.01 vs晚分泌期正常子宫内膜
表2 四组标本PRB/PRAB、PRB/PRA蛋白的研究结果
3 讨论
临床治疗和实验室依据都表明EMS异位灶存在孕激素抵抗。Zong【2】在研究PR基因敲除的EMS鼠模型时发现异位灶孕激素抵抗可能与PR受体基因功能缺陷有关，刺激了雌激素依赖性和非雌激素依赖性的异位内膜生长。Misao【5】等用RT-PCR技术研究了巧囊壁中PR-A、PR-B的表达，发现异位内膜PR-B/PR-A值显著高于在位子宫内膜，认为异位内膜过多表达PR-B使孕激素无法调节异位灶生长；Attia【6】等用免疫印迹蛋白技术（Westerblot）发现盆腹膜异位灶异位内膜无PR-B只有PR-A蛋白表达，推测这可能是EMS发病的原因之一。这两位作者取不同部位的异位灶，用不同的实验方法，结果相反，但均未从组织病理学角度探讨孕激素亚受体的改变。虽然临床上巧囊患者多，但所取临床标本在未行组织学检查前，我们肉眼无法确定标本有无明显的异位腺上皮和间质或卵巢组织混杂，故我们在入选试验组前行HE染色，镜下可见异位的腺上皮和间质细胞者方纳入试验组，故共取70个巧囊壁标本，但仅45个标本纳入试验组。如用RT-PCR 或Westernblot技术很难保证试验结果的可靠性。本试验从组织学角度用免疫组化实验能直观地研究异位腺体或间质细胞中孕激素亚受体的改变在EMS孕激素抵抗中的作用。
3.1 PRA、PRB生理功能
PRB和PRA为同一基因编码，由两种不同的启动子、两个不同位置的翻译起始密码子分别转录和翻译。PRB活化转录作用强于PRA， 没有PRA的拮抗，子宫内膜上皮异常增生；PRA活化转录作用弱，可对抗雌激素诱导的上皮增生，还可抑制PRB与P结合所表现的潜在的上皮增生【7】。PR通常以二聚体形式存在，靶细胞中PRA、PRB蛋白比值不同可能会改变各种二聚化的相对成分，从而影响整个细胞对孕激素的反应，这两种亚受体的相对表达水平可能是孕激素治疗雌激素依赖性疾病是否有效的关键。
3.2巧囊异位灶17β-HSD2表达缺失及意义
人正常子宫内膜主要表达17β-HSD1、2，17β-HSD1能将E1转化成活性高的E2，而17β-HSD2能氧化E2为E1【8】。有研究报道【9，10，11】研究发现子宫内膜腺上皮中17β-HSD2是由孕激素與间质细胞中PR作用以旁分泌机制在转录和翻译水平诱导并激活。我们的研究结果发现巧囊组异位灶无17β-HSD2的表达，故提示异位灶局部存在孕激素抵抗现象，孕激素不能与间质中的PR作用诱导异位内膜上皮产生17β-HSD2，异位灶高活性的E2缺乏一条重要的降解途径，使其局部E2浓度升高，促进了内异灶的异常生长。但异位症患者局部及腹腔液中的孕激素水平均高于正常患者，异位间质细胞中的PR与正常内膜无显著差异，故本研究推测巧囊异位灶中孕激素抵抗可能与腺体或间质中孕激素亚受体异常有关。
3.3巧囊异位腺上皮PR（A+B）、PRA、PRB蛋白的改变及意义
PRB负责子宫腺上皮增生期、分泌期的有丝分裂和分泌，PRA负责间质细胞的有丝分裂、分化和前蜕膜变。本研究结果示：巧囊壁腺上皮中PRA、PRB表达绝对减少，PRB/PRA、PRB/PR（A+B）比值大于正常内膜，故腺上皮中以PRB表达为主，PRA相对也减少；。近来研究【12】发现子宫内膜癌中，过多表达PRB的癌细胞具有更高的增生活性和侵蚀性。巧囊壁的异位腺上皮整个月经周期都保持较强的有丝分裂和增生可能与相对多的PRB和没有足够PRA的拮抗共同促进异位内膜上皮增生有关。PRB比PRA转录激活作用强，能调节靶组织对P的反应，巧囊壁异位腺上皮PRB的绝对减少使腺上皮对P反应差，这可能与临床上用孕激素治疗EMS患者反应差有关。因靶组织中PRA、PRB的比值和表达量的改变可通过调节特异的孕激素反应元件影响孕激素对靶组织的作用，巧囊部分孕激素抵抗可能与腺上皮中PR（A+B）、PRA、PRB绝对减少及比值的改变相关。
3.4巧囊异位间质细胞PR（A+B）、PRA、PRB蛋白的改变在其发病中的作用
间质细胞在苗勒氏管源性组织的上皮分化和增生尤其初始生长时发挥重要的作用。孕激素抑制E2诱导的上皮DNA合成是由间质中的PR调节，上皮中的PR并没有参与调节。子宫内膜腺上皮的生长是E2通过上皮和间质的相互作用后，间质发出上皮生长信号调节，故间质可能在调节内膜上皮增生中发挥关键作用。Haslam SZ【13】在对雌激素依赖性疾病乳腺癌的研究中，提出了间质依赖学说，认为E2和孕激素对乳腺癌的生长调节是通过间质作用的。我们的实验发现异位间质中PR并未减少，重要的是其亚受体PRB绝对增加 ，PRB/PRA显著高于正常改变。PRB过表达和PRA表达相对减少使间质无法发挥其抑制E2诱导的上皮有丝分裂，故巧囊壁异位灶持续生长和种植；可能异位间质中PRA的相对较少使PRA与P结合不能充分发挥其促进间质分化的作用，这也可解释本实验观察到的间质不成熟生长和分泌晚期异位间质细胞增生活跃等现象。间质是调节上皮作用的介质，间质中的PRA是联系间质和上皮交互作用的介质，间质中PR或PRA、PRB是调节上皮生长的信号，可能间质中PRB的绝对增多和PRA的相对减少使间质无法产生抑制增生信号而使异位上皮持续增生，在EMS发病中发挥重要的作用。研究表明【14】PRA抑制血管生成，PRB促进血管生成。巧囊壁间质中绝对高表达PRB和相对低表达PRA可能对巧囊壁间质丰富的血管生成起到一定的作用。以上都表明EMS的间质细胞在EMS的发病中可能起到初始化作用。 本研究結果发现巧囊壁异位细胞中孕激素亚受体异位内膜PR（A+B）、PRA、PRB不仅绝对量发生了改变；腺上皮和间质中PRB/PRA的比值与正常内膜不同，可能使内异灶局部孕激素抵抗，不能诱导17β-HSD2表达，致局部雌激素积聚，异位腺上皮生长，可能使P不能发挥正常的生理作用而表现为异位灶局部孕激素抵抗，孕激素不能发挥其正常的拮抗雌激素、抗炎、促进凋亡、调节免疫平衡，抑制血管增生、促进腺上皮分化等作用；异位内膜局部雌激素堆积，异位灶生长活跃；故孕激素抵抗是EMS发病机制中重要的一环。而且本研究为子宫内膜异位症的临床药物治疗提供新的作用靶点，选择性的孕激素亚受体调节剂或激动剂可能可以调节异位灶孕激素亚受体。
参考文献：
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关键词：卵巢子宫内膜异位症；17β-羟甾类固醇脱氢酶Ⅱ；孕激素受体，孕激素；
Abstract： Objective To study the correlation between progestin resistance and the expression of progesterone receptor subtypes in the epithelial and stromal cells and 17-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 （17β-HSD2） throughout the menstrual cycle of human ovarian endometriosis. Methods PT-PCR was used to assess 17β-HSD2 messenger RNA（mRNA） expression of 45 ovarian endometriosis and 35 normal eutopic endometrium throughout the menstrual cycle； immunohistochemical assay was performed to examin the protein expression of PRA， PRB and PRAB（PRA+PRB） in the above cases. Results （1） In all ovarian endometriosis， 17β-HSD2 mRNA could not be checked， however， in normal eutopic endometrium， the expression of 17β-HSD2 mRNA during the secretory phase was positive. （2）In the glandular epithelium of ovarian endometriosis， the expression of PRB， PRA and PR（A+B） protein was statistically significantly lower than that in the normal endometrium（P<0.01）， in the stromal cells of ovarian endometriosis，the expression of PRB was statistically significantly higher than that in the normal endometrium（P<0.01）. But the expression of PRA and PR（A+B） protein shows no difference in the normal endometrium（P﹥0.05）. In ovarian endometriosis， the expression of PRB、PRA and PR（A+B） protein has no cyclic variation throughout the cycle， the ratio of PRB / PRA in the glandular epithelium and stromal cells was significantly higher than that in normal endometrium（P﹤0.01）. Conclusion The abnormal expression of stomal progesterone receptor B， A in ovarian endometriosis ， which may be responsible for the local progestin resistance， fail to induce the expression of 17β-HSD2 and up-regulate the local estrogen concentration in endometriosis. Thus high estrogen level in endometriosis promoted the growth of ectopic epithelial cells. the present results suggested endometriotic stroma probably plays a primordial role in the development and growth of endometriosis.
keywords：17-hydroxysteroid dehydrogenase type 2； progesterone receptor ；； progestin； ovarian endometriosis 子宫内膜异位症（EMS）是一种雌激素依赖性疾病，雌二醇（E2）是异位内膜生长强有丝分裂原，正常子宫内膜孕激素与孕激素受体（PR）作用后通过部分拮抗E2抑制异位内膜的生长，17β-羟甾类固醇脱氢酶Ⅱ（17β-HSD2）是E2氧化酶，也能降解E2为活性低的雌酮（E1）。已有研究表明EMS异位上皮无17β-HSD2表达；临床上用孕激素治疗EMS，50%的患者无效且易复发；Shaw【1】研究发现 EMS患者内异灶局部及增生期腹腔液中孕激素水平比正常人高，高水平的孕激素不但未能拮抗E2，还促进异位灶生长，17β-HSD2由孕激素与内膜间质细胞中的PR作用诱导并激活，这些孕激素抵抗现象都说明异位灶PR功能可能缺陷。既往研究认为异位间质细胞中的PR表达与正常内膜无差异，故本研究提出假设：异位内膜组织的异位腺体或间质细胞中PR亚型分布及量的改变可能是局部孕激素抵抗原因之一。我们用免疫组化检测巧囊异位腺上皮和间质细胞中PRA、PRB表达，以探讨其改变与孕激素抵抗的关系。
1 材料和方法
1.1研究对象 巧囊组：2003年10月至2004年12月在福建医科大学附属第一医院及福建省妇幼保健院行腹腔镜或开腹手术获70例标本，实验前用HE染色行组织病理学鉴定，镜下可见异位腺上皮和间质细胞者纳入试验组，共45例；正常对照组：取35例未经放、化疗治疗的宫颈癌Ia患者的子宫内膜标本为对照组。以上两组患者均为已婚，至少术前三个月未用任何激素类药物治疗，有正常的月经周期（26-31天），年龄（29±5）岁 （23岁～40岁）。对照组正常内膜月经期别根据其月经周期和Noye’s分期标准来证实其确切的组织形态学分期。
1.2试剂来源： RT-PCR试剂：一步法RNA提取试剂TRIZOL购自美国Promeger公司；RT-PCR反转录试剂盒购自MBI公司，Taq酶购自上海博亚生物公司。免疫组化试剂：鼠抗人PR（A+B） 单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人PRA和PRB单克隆抗体购自美国NeoMarkers公司；二抗为羊抗免疫球蛋白，购自美国DAKO公司。由于PR受体基因的特殊性，无法针对PRA设计出特异的抗体，但研究表明【2】本实验所选克隆型号为hPRa7的一抗特异性识别PRA， hPRa2型单克隆抗体特异性识别PRB。
1.3方法
1.3.1取材 刮取宫底和宫后壁的正常子宫内膜和取经开腹或腹腔镜手术确诊的巧囊壁，磷酸盐缓冲液冲洗标本3次，一部分标本离体后20min内取50mg新鲜组织，立即冻存于-72℃超低温冰箱中，2 hr内提取总RNA；一部分标本立即固定于4%多聚甲醛中，乙醇脱水、石蜡包埋、切片机连续切片。
1.3.2 17β-HSD2 mRNA表达水平（1）组织中总RNA的提取：用Trizol提取标本组织总RNA，严格按试剂盒说明书操作；（2）引物设计：17β-HSD2 引物序列 上游引物（F）5"-CGGTGCTCCAAATGGACATCAC-3' 下游引物（R）5'- GGATGGAAGCAACTTTAATTCCCC -3'，目的基因片断大小為384bp；内参序列：上游（F）5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3'，下游（R）5'-ATG TCACGCCACGATTTCCCG C -3'，扩增判断长度为500bp【3】。引物由上海生工合成。（3）逆转录：严格按照试剂盒说明书操作，逆转录合成cDNA，反应条件为42℃1h，70℃10min。（4）PCR扩增目的基因片断，以β-Actin为内参照。PCR反应条件：95℃预变性5min后，按照95℃30s、57℃30s、72℃30s反复进行35个循环，最后72℃延伸10min。（5）PCR产物分析：PCR产物经1.5%的琼脂凝胶电泳完毕后用密度扫描仪分析其光密度值，以17β-HSD2与β-actin吸光度比值来反应该基因mRNA的表达量。
1.3.3免疫组化检测及判断PR（A+B）、PRA、PRB蛋白表达水平 采用免疫组化两步法（LDP，labbled dextran polymer method）检测。由两位病理科医生采用双盲法判断试验结果。三种抗体均表达在腺上皮和间质细胞核内，阳性染色者在细胞核内有棕黄色颗粒沉着。判断标准如下【4】：选择具有代表性的异位腺上皮和间质细胞的10个高倍镜视野（×400）观察，并随机计数100个腺上皮或间质细胞，结果依染色的强弱和染色的百分比两项来评分判断。染色的强弱得分标准：弱表达为1分，中度表达为2分，强表达为3分，无表达为0分；半定量得分=∑阳性细胞染色强度×阳性细胞百分数。
1.3统计学处理
采用SPSS12.0统计软件进行统计分析。计量资料以X±s表示，组间和组内比较用LSD检验。P<0.05表明有统计学意义。
2 结果
2.1巧囊、正常内膜两组17β-HSD2 mRNA的表达
正常内膜组增生早中期无17β-HSD2mRNA表达；分泌晚期表达显著高于分泌早中期；巧囊组45例增生期和分泌期均无17β-HSD2mRNA的表达（见表1）。
表1两组子宫内膜中17β-HSDⅡmRNA的表达
﹡P<0.05 vs正常增生晚期和分泌早中期
图1：17β-HSD2mRNA在巧囊和对照组中的电泳图
1：Marker；2、3、4：增生期，分泌早期，分泌晚期对照组；5：巧囊组
2.2 正常子宫内膜腺上皮和间质细胞中PR（A+B）、PRA、PRB蛋白表达
PR（A+B）是总孕激素受体，包含PRA和PRB，观看连续切片的组化片，子宫内膜同一腺上皮和间质细胞中，同时表达PRA和PRB。增生期PRA、PRB表达无统计学差异；增生中晚期达高峰，自分泌早期始，PRA、PRB减少，分泌晚期几乎无表达。整个月经周期间质主要以PRA表达为主，PRB表达少，增生中晚期达高峰，至分泌晚期仍有散在的细胞表达PRA 2.3巧囊异位内膜腺上皮和间质细胞中PR（A+B）、PRA、PRB蛋白表达
异位腺上皮细胞中PR（A+B）表达少于正常对照组（P<0.01），PRB、PRA明显低于正常内膜，以PRA的减少为甚（P<0.01）；异位间质细胞PR（A+B）、PRA与正常内膜无差异（P>0.05），PRB显著高于正常内膜（P<0.01）；但异位腺上皮和间质细胞中PRB/PRA、PRB/PR（A+B）显著高于正常内膜；异位间质细胞中分泌晚期PRA、PRB表达与增生期、分泌早、中期无显著差异，且PR（A+B）、PRA、PRB的表达无周期性改变。
图2 间质细胞中PRA and PRB 蛋白表达
注：NE：正常对照组；OE：巧囊组；PP：增生期；ESP：分泌早期；LSP：分泌晚期
★P<0.01 vs晚分泌期的正常内膜
图3腺上皮细胞中PRA and PRB 蛋白表达
注：* P<0.01 vs增生期和分泌早期的正常内膜；△ P<0.05 vs增生期和分泌早期（）；★P<0.01 vs晚分泌期正常子宫内膜
表2 四组标本PRB/PRAB、PRB/PRA蛋白的研究结果
3 讨论
临床治疗和实验室依据都表明EMS异位灶存在孕激素抵抗。Zong【2】在研究PR基因敲除的EMS鼠模型时发现异位灶孕激素抵抗可能与PR受体基因功能缺陷有关，刺激了雌激素依赖性和非雌激素依赖性的异位内膜生长。Misao【5】等用RT-PCR技术研究了巧囊壁中PR-A、PR-B的表达，发现异位内膜PR-B/PR-A值显著高于在位子宫内膜，认为异位内膜过多表达PR-B使孕激素无法调节异位灶生长；Attia【6】等用免疫印迹蛋白技术（Westerblot）发现盆腹膜异位灶异位内膜无PR-B只有PR-A蛋白表达，推测这可能是EMS发病的原因之一。这两位作者取不同部位的异位灶，用不同的实验方法，结果相反，但均未从组织病理学角度探讨孕激素亚受体的改变。虽然临床上巧囊患者多，但所取临床标本在未行组织学检查前，我们肉眼无法确定标本有无明显的异位腺上皮和间质或卵巢组织混杂，故我们在入选试验组前行HE染色，镜下可见异位的腺上皮和间质细胞者方纳入试验组，故共取70个巧囊壁标本，但仅45个标本纳入试验组。如用RT-PCR 或Westernblot技术很难保证试验结果的可靠性。本试验从组织学角度用免疫组化实验能直观地研究异位腺体或间质细胞中孕激素亚受体的改变在EMS孕激素抵抗中的作用。
3.1 PRA、PRB生理功能
PRB和PRA为同一基因编码，由两种不同的启动子、两个不同位置的翻译起始密码子分别转录和翻译。PRB活化转录作用强于PRA， 没有PRA的拮抗，子宫内膜上皮异常增生；PRA活化转录作用弱，可对抗雌激素诱导的上皮增生，还可抑制PRB与P结合所表现的潜在的上皮增生【7】。PR通常以二聚体形式存在，靶细胞中PRA、PRB蛋白比值不同可能会改变各种二聚化的相对成分，从而影响整个细胞对孕激素的反应，这两种亚受体的相对表达水平可能是孕激素治疗雌激素依赖性疾病是否有效的关键。
3.2巧囊异位灶17β-HSD2表达缺失及意义
人正常子宫内膜主要表达17β-HSD1、2，17β-HSD1能将E1转化成活性高的E2，而17β-HSD2能氧化E2为E1【8】。有研究报道【9，10，11】研究发现子宫内膜腺上皮中17β-HSD2是由孕激素與间质细胞中PR作用以旁分泌机制在转录和翻译水平诱导并激活。我们的研究结果发现巧囊组异位灶无17β-HSD2的表达，故提示异位灶局部存在孕激素抵抗现象，孕激素不能与间质中的PR作用诱导异位内膜上皮产生17β-HSD2，异位灶高活性的E2缺乏一条重要的降解途径，使其局部E2浓度升高，促进了内异灶的异常生长。但异位症患者局部及腹腔液中的孕激素水平均高于正常患者，异位间质细胞中的PR与正常内膜无显著差异，故本研究推测巧囊异位灶中孕激素抵抗可能与腺体或间质中孕激素亚受体异常有关。
3.3巧囊异位腺上皮PR（A+B）、PRA、PRB蛋白的改变及意义
PRB负责子宫腺上皮增生期、分泌期的有丝分裂和分泌，PRA负责间质细胞的有丝分裂、分化和前蜕膜变。本研究结果示：巧囊壁腺上皮中PRA、PRB表达绝对减少，PRB/PRA、PRB/PR（A+B）比值大于正常内膜，故腺上皮中以PRB表达为主，PRA相对也减少；。近来研究【12】发现子宫内膜癌中，过多表达PRB的癌细胞具有更高的增生活性和侵蚀性。巧囊壁的异位腺上皮整个月经周期都保持较强的有丝分裂和增生可能与相对多的PRB和没有足够PRA的拮抗共同促进异位内膜上皮增生有关。PRB比PRA转录激活作用强，能调节靶组织对P的反应，巧囊壁异位腺上皮PRB的绝对减少使腺上皮对P反应差，这可能与临床上用孕激素治疗EMS患者反应差有关。因靶组织中PRA、PRB的比值和表达量的改变可通过调节特异的孕激素反应元件影响孕激素对靶组织的作用，巧囊部分孕激素抵抗可能与腺上皮中PR（A+B）、PRA、PRB绝对减少及比值的改变相关。
3.4巧囊异位间质细胞PR（A+B）、PRA、PRB蛋白的改变在其发病中的作用
间质细胞在苗勒氏管源性组织的上皮分化和增生尤其初始生长时发挥重要的作用。孕激素抑制E2诱导的上皮DNA合成是由间质中的PR调节，上皮中的PR并没有参与调节。子宫内膜腺上皮的生长是E2通过上皮和间质的相互作用后，间质发出上皮生长信号调节，故间质可能在调节内膜上皮增生中发挥关键作用。Haslam SZ【13】在对雌激素依赖性疾病乳腺癌的研究中，提出了间质依赖学说，认为E2和孕激素对乳腺癌的生长调节是通过间质作用的。我们的实验发现异位间质中PR并未减少，重要的是其亚受体PRB绝对增加 ，PRB/PRA显著高于正常改变。PRB过表达和PRA表达相对减少使间质无法发挥其抑制E2诱导的上皮有丝分裂，故巧囊壁异位灶持续生长和种植；可能异位间质中PRA的相对较少使PRA与P结合不能充分发挥其促进间质分化的作用，这也可解释本实验观察到的间质不成熟生长和分泌晚期异位间质细胞增生活跃等现象。间质是调节上皮作用的介质，间质中的PRA是联系间质和上皮交互作用的介质，间质中PR或PRA、PRB是调节上皮生长的信号，可能间质中PRB的绝对增多和PRA的相对减少使间质无法产生抑制增生信号而使异位上皮持续增生，在EMS发病中发挥重要的作用。研究表明【14】PRA抑制血管生成，PRB促进血管生成。巧囊壁间质中绝对高表达PRB和相对低表达PRA可能对巧囊壁间质丰富的血管生成起到一定的作用。以上都表明EMS的间质细胞在EMS的发病中可能起到初始化作用。 本研究結果发现巧囊壁异位细胞中孕激素亚受体异位内膜PR（A+B）、PRA、PRB不仅绝对量发生了改变；腺上皮和间质中PRB/PRA的比值与正常内膜不同，可能使内异灶局部孕激素抵抗，不能诱导17β-HSD2表达，致局部雌激素积聚，异位腺上皮生长，可能使P不能发挥正常的生理作用而表现为异位灶局部孕激素抵抗，孕激素不能发挥其正常的拮抗雌激素、抗炎、促进凋亡、调节免疫平衡，抑制血管增生、促进腺上皮分化等作用；异位内膜局部雌激素堆积，异位灶生长活跃；故孕激素抵抗是EMS发病机制中重要的一环。而且本研究为子宫内膜异位症的临床药物治疗提供新的作用靶点，选择性的孕激素亚受体调节剂或激动剂可能可以调节异位灶孕激素亚受体。
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