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【摘要】 目的：探讨不同HLA-B27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性及其动态表达量与强直性脊柱炎疾病活动指数（BASDAI）的关系。方法：收集骨科门诊强直性脊柱炎患者应用流式细胞术定性检测HLA-B27阳性100例，HLA-B27阳性健康对照组30例，通过PCR-SSP（序列引物扩增法）技术检测HLA-B27基因亚型；荧光实时定量RT-PCR技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的mRNA，统计分析两组HLA-B27mRNA 表达量及HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数的相关性。结果：100例AS患者检出HLA-B2704亚型55例，HLA-B2705亚型45例，30对照组检出HLA-B2704亚型13例，HLA-B2705亚型12例，HLA-B2706亚型3例，HLA-B2709亚型2例；HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平最低值为1.16，最高值为37.01，均值7.77，HLA-B27阳性健康对照组表达水平最低1.05，最高值2.10，均值为1.51，两组差异有统计学意义（P=0.002）；HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数密切相关（R=0.707）。结论：本地区AS患者HLA-B27基因亚型以B2704和B2705为主，B2706及B2709可能为保护亚型；HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平高于HLA-B27阳性健康者；HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数呈正相关。
【关键词】 強直性脊柱炎； HLA-B27； 基因； 亚型； 定量； 动态表达
强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis AS）是一种类风湿因子阴性，主要累及中轴关节和肌腱韧带附着点的慢性进行性炎症疾病，可引起腰痛、晨僵、脊柱活动受限、驼背畸形、外周关节受累、肌腱端炎、足跟痛等关节症状以及眼部前葡萄膜炎、心血管表现、肺部表现、骨质疏松等关节外症状，AS致残率高，早期确诊对AS患者非常重要。AS与HLA-B27（Human Leucocyte Antigen B27，人类白细胞抗原B27）关系密切已被公认，90%以上的AS患者HLA-B27呈阳性。人们发现HLA-B27在基因水平上存在较大异质性，存在多个等位基因，不同亚型有着不同的地域和人种分布特点。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。本研究将对东莞地区HLA-B27阳性患者及健康人的HLA-B27基因亚型进行检测，揭示本地区主要致病亚型及可能的保护亚型，并从HLA-B27基因亚型的动态表达量揭示与AS的相关性，为本地区AS的防治提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2010年3月-2012年12月本院骨科门诊HLA-B27阳性的AS确诊患者100例（符合1983年修订的纽约标准），男81例，女19例， 年龄13～70岁，平均（29±8.37）岁；HLA-B27阳性健康对照组30例，男24例，女6例，年龄14～65岁，平均（30±6.45）岁。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 试验仪器与试剂 BDcanto2流式细胞仪由美国BD公司生产，HLA-B27荧光抗体F1（FITC）、CD3荧光抗体F2（PE）、校准微球和溶血素均来自BD公司。PCR仪器购自上海宏石SLAN，高速离心机购自ACI公司，型号PK121R。电泳仪购自Bio-Rad公司，型号PvowerPAC200，全血DNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自宝生物大连有限公司，DNA测序仪由美国ABI公司生产，型号3130。
1.2.2 应用流式细胞术定性检测外周血T淋巴细胞HLA-B27 定性检测：抽取HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组外周静脉血100 uL，EDTA抗凝，采用BD公司HLA-B27试剂盒，按照说明书步骤进行，在BDcanto2流式细胞仪上检测，结果判断为阴性/阳性。
1.2.3 HLA-B27基因亚型测定 采用PCR-SSP（序列引物扩增法）技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的DNA。酚氯法提取外周血液细胞DNA，按照WHO2009年公布的44个HLA-B27等位基因，选择相关亚型的引物试剂盒，进行DNA扩增，凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终产物。
1.2.4 HLA-B27亚型的mRNA定量 荧光实时定量RT-PCR技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的mRNA，Trizol法提取外周血液细胞RNA，逆转录为cDNA，荧光实时定量扩增，观察和记录结果。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，计量资料用（x±s）表示，两组HLA-B27mRNA 表达水平比较采用t检验，对HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数进行Pearson相关统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 100例HLA-B27阳性AS患者检出HLA-B2704亚型55例，HLA-B2705亚型45例，30例HLA-B27阳性健康对照组检出HLA-B2704亚型13例，HLA-B2705亚型12例，HLA-B2706亚型3例，HLA-B2709亚型2例。
2.2 100例HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平最低值为1.16，最高值为37.01，均值（7.77±6.19），30例HLA-B27阳性健康对照组表达水平最低1.05，最高值2.10，均值（1.51±0.27），两组比较差异有统计学意义（P=0.002）；HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数密切相关（R=0.707）。 3 讨论
AS是一种主要累及中轴关节的慢性进行性炎症疾病，临床表现为腰、骶以及下肢关节疼痛，晚期患者脊柱僵硬、活动受限。我国AS发病率约为0.3%，多见于中青年男性。AS致残率高，早期确诊对强直性脊柱炎患者非常重要。目前的AS确诊方法主要是依靠临床表现和影像学、实验室检查结果。AS与HLA-B27关系密切已被公认，90%以上的AS患者HLA-B27呈阳性。1973年Brewerton和Schlosstein [1-2]首次报道HLA-B27与AS相关以来，AS是迄今已知的HLA-B27与疾病关联最强、最典型的疾病。因此临床研究中找出本地区HLA-B27基因亚型及基因亚型表达量与AS的病情关系，为本地区AS的诊治提供理论和临床依据具有重要意义。
研究显示，HLA-B27亚型在不同的种族和地区中分布情况不同。2009年WHO正式命名的HLA-B27等位基因已达44个，不同亚型有着不同的地域和人种分布特点[3]，如B2705亚型几乎见于所有人种，但B2703亚型主要见于西非人群，而B2704亚型则是中国汉族人的优势亚型。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。有报道认为，2705、2704、2702亚型与AS的发生呈正相关，而2703、2708、2709、2707与AS的发生呈负相关[4-6]，而2706亚型则被普遍认为是AS的保护性基因。本研究显示：本地区HLA-B27阳性患者仅发现2704与2705亚型，且2704亚型占55%，2705亚型占45%，HLA-B27阳性健康者发现4种亚型，2704亚型占43.33%，2705亚型占40%，2706亚型占10%，2709亚型占6.7%。揭示本地区主要亚型分布为2704亚型与2705亚型，且2704亚型为优势亚型，而2706亚型及2709亚型仅见于HLA-B27阳性健康者，提示2706亚型及2709亚型为本地区保护亚型。
HLA-B27在AS发生中的病理作用目前尚不十分清楚。作为一种重要的免疫分子，HLA-B27主要功能是与抗原结合并将其提呈给T淋巴细胞，这一功能在AS和正常人中都有表现。HLA-B27重链可以形成同源二聚体，大多数AS患者T淋巴细胞都能表达这种二聚体的配体，这说明HLA-B27重链二聚体可能参与了AS的病理发生过程，而HLA-B27可能在免疫过程中具有重要作用[7-8]。因为通过检测HLA-B27基因亚型无法有效区分AS患者及HLA-B27阳性健康人，采用定量PCR检测HLA-B27mRNA表达有可能解决这一问题。本研究对HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组均进行了RT-PCR技术检测，发现两组HLA-B27mRNA表达量差异有统计学意义（P=0.002），HLA-B27阳性AS患者呈现高表达，而HLA-B27阳性健康对照组呈现低表达。这也说明了本地区虽然HLA-B27基因亚型无论是AS患者或是健康人均是2704及2705，基因亚型高表达者患病，低表达者未患病。同时提示基因型低表达的HLA-B27阳性健康者随着基因亚型表达量增加可能成为AS患者，因此临床工作中对HLA-B27阳性健康人进行RT-PCR技术检测HLA-B27mRNA表达量，作为一种辅助诊断的有效手段，可以更早期发现AS患者，使AS的防治真正达到早发现、早诊断、早治疗，将AS的致残率降到最低。
AS患者关于其疾病活动性评价，目前临床大多数专家认可的、应用最为广泛的是毕氏强直性性脊椎炎疾病活动指数（BASDAI），它与腰椎MRI急性炎症评分有很好的一致性[9]，虽然新的直性脊柱炎病情活动度评分（ASDAS）在判断AS患者病情活动度时的敏感性稍高[10]，但毕氏法仅需患者对自身病情的主观评价，无需MRI及过多的抽血化验等高成本检查，在中国仍最常用，能够反映患者的病变活动性。本研究发现HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与AS患者毕氏疾病活动指数密切相关（R=0.707），这也为进一步从分子水平治疗AS提供了有力证据，未来可能通过转录水平的调控，降低AS患者的HLA-B27mRNA表达量来减轻AS患者的病情。但HLA-B27是人类基因中的一个等位基因，具有高度的多态性，不同地区及种族中存在明显差异，仍需进一步从转录、翻译调控等分子水平作更多的研究[11]。总之，本研究揭示本地区HLA-B27基因主要致病亚型和可能的保护亚型，并从分子转录水平揭示了HLA-B27基因动态表达量与强直性脊柱炎患者疾病活动指数相关性，为临床及早防治AS提供了新的理论依据，具有重要临床意义。
参考文献
[1] Brewerton D A，Hart F D，Nicholls A ，et al.Ankylosing spondylitis and HL-A27[J].Lancet，1973，1（7809）：904-907.
[2] Schlosstein L，Terasaki P I，Bluestone R，et al.High Association of an HLA antigen B27 with Ankylosing spondylitis[J].New England Med，1973，288（14）：704-706.
[3] Duanqchanchot M，Puapairoj C，Romphruk A，et al.HLA-B27 subtypes in Northern and Northeastern Thais，Karens，and Bamars determined by a high-resolution PCR-SSP technique[J].Tissue Antigens，2009，73（6）：590-594.
[4] Lopez-Larrea C，Sujirachato K，Mohra N K，et al.HLA-B27 subtypes in Asian patients with ankylosing spondilitis[J].Tissue Antigens，1995，45（3）：169-176.
[5] 汪薇，李志強.HLA-B27基因亚型与强直性脊椎炎的相关性研究[J].临床输血与检验，2009，11（4）：376-379.
[6] 汪薇，李志强.HLA-B27基因亚型与强直性脊椎炎临床特征的相关性研究[J].临床输血与检验，2010，12（1）：31-35.
[7] Turner M J，Delay M L，Bai S，et al.HLA-B27 up-regulation causes accumulation of misfolded heavy chains and crrelates with the magnitude of the unfolded protein response in transgenic rats：Implications for the pathogenesis of spondylarthritis-like disease[J].Arthritis Rheum，2007，56（1）：215-223.
[8] Bowness P. HLA B27 in health and disease： a double-edged sword？ [J]. Rheumatology，2002，41（7）：857-868.
[9] 孔庆聪，邵硕，刘卫敏，等.磁共振联合HLA-B27诊断早期强直性脊柱炎的应用价值[J].实用放射学杂志，2012，28（7）：1083-1086.
[10] 林旭娜，李宴，张胜利，等.强直性脊柱炎病情活动度评分对强直性脊柱炎患者病情活动性判断的价值[J].中华内科杂志，2012，51（3）：206-209.
[11] 李梦远，姚中强，刘湘源.HLA-B27与强制性脊柱炎免疫学机制的研究进展[J].生理科学进展，2011，42（1）：16-20.
（收稿日期：2013-06-03） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 強直性脊柱炎； HLA-B27； 基因； 亚型； 定量； 动态表达
强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis AS）是一种类风湿因子阴性，主要累及中轴关节和肌腱韧带附着点的慢性进行性炎症疾病，可引起腰痛、晨僵、脊柱活动受限、驼背畸形、外周关节受累、肌腱端炎、足跟痛等关节症状以及眼部前葡萄膜炎、心血管表现、肺部表现、骨质疏松等关节外症状，AS致残率高，早期确诊对AS患者非常重要。AS与HLA-B27（Human Leucocyte Antigen B27，人类白细胞抗原B27）关系密切已被公认，90%以上的AS患者HLA-B27呈阳性。人们发现HLA-B27在基因水平上存在较大异质性，存在多个等位基因，不同亚型有着不同的地域和人种分布特点。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。本研究将对东莞地区HLA-B27阳性患者及健康人的HLA-B27基因亚型进行检测，揭示本地区主要致病亚型及可能的保护亚型，并从HLA-B27基因亚型的动态表达量揭示与AS的相关性，为本地区AS的防治提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2010年3月-2012年12月本院骨科门诊HLA-B27阳性的AS确诊患者100例（符合1983年修订的纽约标准），男81例，女19例， 年龄13～70岁，平均（29±8.37）岁；HLA-B27阳性健康对照组30例，男24例，女6例，年龄14～65岁，平均（30±6.45）岁。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 试验仪器与试剂 BDcanto2流式细胞仪由美国BD公司生产，HLA-B27荧光抗体F1（FITC）、CD3荧光抗体F2（PE）、校准微球和溶血素均来自BD公司。PCR仪器购自上海宏石SLAN，高速离心机购自ACI公司，型号PK121R。电泳仪购自Bio-Rad公司，型号PvowerPAC200，全血DNA提取试剂盒、PCR试剂盒购自宝生物大连有限公司，DNA测序仪由美国ABI公司生产，型号3130。
1.2.2 应用流式细胞术定性检测外周血T淋巴细胞HLA-B27 定性检测：抽取HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组外周静脉血100 uL，EDTA抗凝，采用BD公司HLA-B27试剂盒，按照说明书步骤进行，在BDcanto2流式细胞仪上检测，结果判断为阴性/阳性。
1.2.3 HLA-B27基因亚型测定 采用PCR-SSP（序列引物扩增法）技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的DNA。酚氯法提取外周血液细胞DNA，按照WHO2009年公布的44个HLA-B27等位基因，选择相关亚型的引物试剂盒，进行DNA扩增，凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终产物。
1.2.4 HLA-B27亚型的mRNA定量 荧光实时定量RT-PCR技术检测HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组HLA-B27亚型的mRNA，Trizol法提取外周血液细胞RNA，逆转录为cDNA，荧光实时定量扩增，观察和记录结果。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件，计量资料用（x±s）表示，两组HLA-B27mRNA 表达水平比较采用t检验，对HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数进行Pearson相关统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 100例HLA-B27阳性AS患者检出HLA-B2704亚型55例，HLA-B2705亚型45例，30例HLA-B27阳性健康对照组检出HLA-B2704亚型13例，HLA-B2705亚型12例，HLA-B2706亚型3例，HLA-B2709亚型2例。
2.2 100例HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平最低值为1.16，最高值为37.01，均值（7.77±6.19），30例HLA-B27阳性健康对照组表达水平最低1.05，最高值2.10，均值（1.51±0.27），两组比较差异有统计学意义（P=0.002）；HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与强直性脊柱炎患者疾病活动指数密切相关（R=0.707）。 3 讨论
AS是一种主要累及中轴关节的慢性进行性炎症疾病，临床表现为腰、骶以及下肢关节疼痛，晚期患者脊柱僵硬、活动受限。我国AS发病率约为0.3%，多见于中青年男性。AS致残率高，早期确诊对强直性脊柱炎患者非常重要。目前的AS确诊方法主要是依靠临床表现和影像学、实验室检查结果。AS与HLA-B27关系密切已被公认，90%以上的AS患者HLA-B27呈阳性。1973年Brewerton和Schlosstein [1-2]首次报道HLA-B27与AS相关以来，AS是迄今已知的HLA-B27与疾病关联最强、最典型的疾病。因此临床研究中找出本地区HLA-B27基因亚型及基因亚型表达量与AS的病情关系，为本地区AS的诊治提供理论和临床依据具有重要意义。
研究显示，HLA-B27亚型在不同的种族和地区中分布情况不同。2009年WHO正式命名的HLA-B27等位基因已达44个，不同亚型有着不同的地域和人种分布特点[3]，如B2705亚型几乎见于所有人种，但B2703亚型主要见于西非人群，而B2704亚型则是中国汉族人的优势亚型。另外HLA-B27同一亚型在不同人群中与AS的关联也可不同。有报道认为，2705、2704、2702亚型与AS的发生呈正相关，而2703、2708、2709、2707与AS的发生呈负相关[4-6]，而2706亚型则被普遍认为是AS的保护性基因。本研究显示：本地区HLA-B27阳性患者仅发现2704与2705亚型，且2704亚型占55%，2705亚型占45%，HLA-B27阳性健康者发现4种亚型，2704亚型占43.33%，2705亚型占40%，2706亚型占10%，2709亚型占6.7%。揭示本地区主要亚型分布为2704亚型与2705亚型，且2704亚型为优势亚型，而2706亚型及2709亚型仅见于HLA-B27阳性健康者，提示2706亚型及2709亚型为本地区保护亚型。
HLA-B27在AS发生中的病理作用目前尚不十分清楚。作为一种重要的免疫分子，HLA-B27主要功能是与抗原结合并将其提呈给T淋巴细胞，这一功能在AS和正常人中都有表现。HLA-B27重链可以形成同源二聚体，大多数AS患者T淋巴细胞都能表达这种二聚体的配体，这说明HLA-B27重链二聚体可能参与了AS的病理发生过程，而HLA-B27可能在免疫过程中具有重要作用[7-8]。因为通过检测HLA-B27基因亚型无法有效区分AS患者及HLA-B27阳性健康人，采用定量PCR检测HLA-B27mRNA表达有可能解决这一问题。本研究对HLA-B27阳性AS患者及HLA-B27阳性健康对照组均进行了RT-PCR技术检测，发现两组HLA-B27mRNA表达量差异有统计学意义（P=0.002），HLA-B27阳性AS患者呈现高表达，而HLA-B27阳性健康对照组呈现低表达。这也说明了本地区虽然HLA-B27基因亚型无论是AS患者或是健康人均是2704及2705，基因亚型高表达者患病，低表达者未患病。同时提示基因型低表达的HLA-B27阳性健康者随着基因亚型表达量增加可能成为AS患者，因此临床工作中对HLA-B27阳性健康人进行RT-PCR技术检测HLA-B27mRNA表达量，作为一种辅助诊断的有效手段，可以更早期发现AS患者，使AS的防治真正达到早发现、早诊断、早治疗，将AS的致残率降到最低。
AS患者关于其疾病活动性评价，目前临床大多数专家认可的、应用最为广泛的是毕氏强直性性脊椎炎疾病活动指数（BASDAI），它与腰椎MRI急性炎症评分有很好的一致性[9]，虽然新的直性脊柱炎病情活动度评分（ASDAS）在判断AS患者病情活动度时的敏感性稍高[10]，但毕氏法仅需患者对自身病情的主观评价，无需MRI及过多的抽血化验等高成本检查，在中国仍最常用，能够反映患者的病变活动性。本研究发现HLA-B27阳性患者HLA-B27mRNA 表达水平与AS患者毕氏疾病活动指数密切相关（R=0.707），这也为进一步从分子水平治疗AS提供了有力证据，未来可能通过转录水平的调控，降低AS患者的HLA-B27mRNA表达量来减轻AS患者的病情。但HLA-B27是人类基因中的一个等位基因，具有高度的多态性，不同地区及种族中存在明显差异，仍需进一步从转录、翻译调控等分子水平作更多的研究[11]。总之，本研究揭示本地区HLA-B27基因主要致病亚型和可能的保护亚型，并从分子转录水平揭示了HLA-B27基因动态表达量与强直性脊柱炎患者疾病活动指数相关性，为临床及早防治AS提供了新的理论依据，具有重要临床意义。
参考文献
[1] Brewerton D A，Hart F D，Nicholls A ，et al.Ankylosing spondylitis and HL-A27[J].Lancet，1973，1（7809）：904-907.
[2] Schlosstein L，Terasaki P I，Bluestone R，et al.High Association of an HLA antigen B27 with Ankylosing spondylitis[J].New England Med，1973，288（14）：704-706.
[3] Duanqchanchot M，Puapairoj C，Romphruk A，et al.HLA-B27 subtypes in Northern and Northeastern Thais，Karens，and Bamars determined by a high-resolution PCR-SSP technique[J].Tissue Antigens，2009，73（6）：590-594.
[4] Lopez-Larrea C，Sujirachato K，Mohra N K，et al.HLA-B27 subtypes in Asian patients with ankylosing spondilitis[J].Tissue Antigens，1995，45（3）：169-176.
[5] 汪薇，李志強.HLA-B27基因亚型与强直性脊椎炎的相关性研究[J].临床输血与检验，2009，11（4）：376-379.
[6] 汪薇，李志强.HLA-B27基因亚型与强直性脊椎炎临床特征的相关性研究[J].临床输血与检验，2010，12（1）：31-35.
[7] Turner M J，Delay M L，Bai S，et al.HLA-B27 up-regulation causes accumulation of misfolded heavy chains and crrelates with the magnitude of the unfolded protein response in transgenic rats：Implications for the pathogenesis of spondylarthritis-like disease[J].Arthritis Rheum，2007，56（1）：215-223.
[8] Bowness P. HLA B27 in health and disease： a double-edged sword？ [J]. Rheumatology，2002，41（7）：857-868.
[9] 孔庆聪，邵硕，刘卫敏，等.磁共振联合HLA-B27诊断早期强直性脊柱炎的应用价值[J].实用放射学杂志，2012，28（7）：1083-1086.
[10] 林旭娜，李宴，张胜利，等.强直性脊柱炎病情活动度评分对强直性脊柱炎患者病情活动性判断的价值[J].中华内科杂志，2012，51（3）：206-209.
[11] 李梦远，姚中强，刘湘源.HLA-B27与强制性脊柱炎免疫学机制的研究进展[J].生理科学进展，2011，42（1）：16-20.
（收稿日期：2013-06-03） （本文编辑：陈丹云）