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摘要：目的：研究尼可地尔预处理诱导内源性热休克蛋白70（HSP70）表达规律，探讨内源性HSP70对离体供心的保护作用，以寻求更为有效的延长供心保存的方法。
方法：①选取60只成年SD大鼠，雌雄各半，随机分为2组，每组30只。②实验组腹腔注射尼可地尔15次（0.1mg/kg，1次/d）；对照组腹腔注射无菌生理盐水15次（0.1ml/kg，1次/d）。两组大鼠分别于第1、3、6、9、15次腹腔注射药物24h后被处死，摘取心脏，取左心室前壁心肌组织进行HSP70的测定。
结果：尼可地尔预处理能诱导心肌内源性HSP70的表达，表达量随给药次数的增加呈递增趋势。
结论：尼可地尔注射液是有效的诱导心肌产生内源性HSP70的药物，最佳给药时间为连续给药9次。
关键词：药物预处理 尼可地尔 HSP70 心脏移植
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0001-02
器官移植的研究最先以心脏移植起步。但至今仍有很多未解决的难题如供心的来源问题，免疫排异反应问题，移植后移植物的衰竭问题，以及远期冠状血管病变等急待解决。其中供心奇缺是限制心脏移植广泛开展的瓶颈问题，而寻求安全存放更长时间的供心保存方法是目前应对这一瓶颈问题的主要途径之一。热休克蛋白（HSP）是一组所有的细胞能在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白，并能对抗更为严重的应激损伤，是一种生物体内源性保护物质[1]。HSPs是细胞暴露在不同应激状态下所诱导合成的一组保守蛋白质，能够提高细胞在应激情况下的生存率[2]，为此，本实验研究尼可地尔预处理诱导内源性热休克蛋白70（HSP70）表达规律，探讨内源性HSP70对离体供心的保护作用，以寻求更为有效的延长供心保存的方法。
1 实验材料与方法
1.1 实验动物及分组。选取24只成年SD大鼠，由华北煤炭医学院动物中心提供，雌雄各半，体重250-350g，随机分为2组，实验组和对照组，每组12只。
1.2 方法。实验组腹腔注射尼可地尔15次（0.1mg/kg，1次/d）；对照组腹腔注射无菌生理盐水15次（0.1ml/kg，1次/d）。两组大鼠分别于第1、3、6、9、15次腹腔注射药物24h后被处死，摘取心脏。
1.3 摘取心脏标本。将上述各实验亚组的实验动物在相对应的时间点称重后，10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔麻醉，游离股静脉，注射肝素0.03mg/kg肝素化，剪开胸骨、心包后暴露心脏，心脏表面放置冰屑，阻断升主动脉，由主动脉根部注射4℃St-Thomas液4～6ml，待心脏完全停搏，心外膜变白后，摘除供心，修剪后放入4℃St-Thomas液中。供心的热缺血时间控制在约1～2min之内。从St-Thomas液中取出心脏，冰生理盐水冲洗干净，迅速沿房室沟剪去心房，沿室间沟剪掉右室保留左室前壁，于前壁长轴处横切3等份，取中间份标本，置于10%中性甲醛4℃固定24h。然后将固定的心肌组织标本，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。全层心肌连续切片，厚度约5μm，用经粘片剂处理过的载玻片捞片，晾干后置于60℃烤箱烘烤3h后行免疫组化S-P法染色。
1.4 HSP70的测定：免疫组化S-P法检测图像分析，细胞核和/或细胞浆内棕黄色沉淀物为阳性信号，每例切片分别取3个高倍视野（×400），用Image-Pro Plus6.0图像分析系统测量组织细胞光密度值（OD）。
1.5 统计学方法：实验中所得数据均以均数±标准差（X±S）表示，以Excel数据库整理后用SPSS13.0统计软件包进行方差分析及相关分析。以α=0.05为检验水准，P<0.05为有统计学差异，P<0.01为统计学差异显著，P>0.05为无统计学差异。
2 结果
对照组注射天数之间心肌内源性HSP70的表达无统计学意义（P>0.05）；尼可地尔预处理能诱导心肌内源性HSP70的表达，表达量在连续给药9次之前随着给药次数的增加呈递增趋势，统计学差异有显著性（P<0.01）；尼可地尔预处理组连续给药9次后，其内源性HSP70的表达量均明显高于前6次（P<0.01）；连续给药15次与给药6次相比，其内源性HSP70表达量有明显差异（P<0.01），但连续给药15次与给药9次相比，其内源性HSP70表达量已无明显增加（P>0.05），连续给药9次后，其内源性HSP70的表达量递增趋势不明显，见表1。
3 讨论
自1967年世界首例人体原位心脏移植成功以来，心脏移植技术业已基本成熟，但供心资源短缺和供心保存效果仍是目前心脏移植面临的两大难题。心脏不仅是高能量依赖的器官，而且具有收缩功能，其生理和功能的特点，决定了供心保护的复杂性和困难性[3-5]。
供心保存（冷缺血）的安全时限一般维持在4～6小时[6]。在心脏移植过程中，供心从切取到移植入受体体内缺血、缺氧时间较长，而且它在植入受体后要尽快恢复功能，立即承载起全身其它脏器的供血功能。如何加强心肌保护，安全、有效地延长供心冷缺血时间，自然就成了影响心脏移植广泛开展的瓶颈问题。供心的保存效果评价及保存时间长短主要取决于心肌缺血性损伤，在供心的离体冷缺血保存期间，良好的心肌保护可大大减少心脏的缺血性损伤。
热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一组高度保守的多肽，普遍存在于生物体内，是目前备受关注的应激蛋白和内源性保护物质。目前认为HSP70心肌保护作用的可能机理[7-9]有以下几种可能：①MC功能：HSP70可通过结合因缺血而受损的蛋白，修复并维持其结构的稳定性，从而减轻受损蛋白的破坏，达到心肌保护的作用。②维护心肌钙离子的稳定：HSP70可通过改善缺血心肌钙通道内环境，减轻心肌钙离子超载，从而提高心肌收缩力，发挥心肌保护作用。③保护心肌线粒体功能、抗凋亡作用：HSP70具有很好的膜稳定性，可通过稳定线粒体保障细胞能量代谢，从而减轻缺血再灌注损伤。④抑制炎性细胞因子释放，发挥非特异性免疫保护作用。HSP70可通过抑制免疫活性因子如IL-1、NF-kB的转录，发挥抗缺血再灌注损伤的效应。⑤调节敏感性钾通道活性，抑制细胞膜上快钠通道开放而抗再灌注心律失常。⑥保护冠状动脉内皮细胞，调节血管平滑肌舒张功能。⑦改善心肌细胞能量代谢。⑧蛋白降解功能。 尼可地尔虽然在结构上属于硝酸盐类，具有硝酸酯样作用，是临床上常用而且安全的药物，用于实验和临床都是安全的。由于其能诱导心肌大量表达HSP70，所以考虑部分心肌保护作用可能是通过内源性HSP70实现的。实验结果显示：尼可地尔注射液是有效的诱导心肌产生内源性HSP70的药物，连续给药9天者，其诱导HSP70的表达量最高（P<0.01），最佳给药时间为连续给药9次。
综上所述，尼可地尔注射液是有效的诱导心肌产生内源性HSP70的药物。尼可地尔诱导的内源性HSP70对大鼠离体心肌保护作用较好，为探讨安全、有效的供心保护方法提供一种新理念和实验依据。
参考文献
[1] Ritossa FM. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila[J]. Experientia， 1962， 18（1）：571-573
[2] Khalil AA，Kabapy NF，Deraz SF，et al.Heat shock proteins in oncology： Diagnostic biomarkers or therapeutic targets[J].Biochim Biophys Acta，2011，1816（ 2） ： 89-104
[3] Amir G，Rubinsky B，Basheer SY，et al.Improved viability and reduced apoptosis in subzero 21-hour preservation of transplanted rat hearts using antifreeze proteins [J].J Heart Lung Transplant，2005，24 （11）：1915-1929
[4] 黄爱兰，林辉，莫安胜，等.猪供心离体不停跳保存的体外循环[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（31）：5741-5744
[5] 梁胜景，莫安胜，林辉，等.不停跳摘取和保存有完整心包的供心[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（5）：831-834
[6] Jahania MS，Sanchez JA，Narayan P，et al.Heart preservation for transplantation principles and strategies[J].Ann Thorac Surg，1999，68（5）：1983-1987
[7] 郭启仓，赵长全，邬鹏宇等.去甲肾上腺素预处理诱导内源性热休克蛋白70表达对供心保护作用的实验研究.中国医药，2012，07（1）：30-32
[8] Kyratsous CA，Panagiotidis CA.Heat-shock protein fu-sion vectors for improved expression of soluble recombinant proteins in Escherichia coli[J].Methods Mol Biol，2012，824：109-129
[9] Jolesch A，Elmer K，Bendzh，et al.Hsp70，a messenger from hyperthermia for the immune system[J].Eur J Cell Biol，2012，91（ 1）：48-52
方法：①选取60只成年SD大鼠，雌雄各半，随机分为2组，每组30只。②实验组腹腔注射尼可地尔15次（0.1mg/kg，1次/d）；对照组腹腔注射无菌生理盐水15次（0.1ml/kg，1次/d）。两组大鼠分别于第1、3、6、9、15次腹腔注射药物24h后被处死，摘取心脏，取左心室前壁心肌组织进行HSP70的测定。
结果：尼可地尔预处理能诱导心肌内源性HSP70的表达，表达量随给药次数的增加呈递增趋势。
结论：尼可地尔注射液是有效的诱导心肌产生内源性HSP70的药物，最佳给药时间为连续给药9次。
关键词：药物预处理 尼可地尔 HSP70 心脏移植
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0001-02
器官移植的研究最先以心脏移植起步。但至今仍有很多未解决的难题如供心的来源问题，免疫排异反应问题，移植后移植物的衰竭问题，以及远期冠状血管病变等急待解决。其中供心奇缺是限制心脏移植广泛开展的瓶颈问题，而寻求安全存放更长时间的供心保存方法是目前应对这一瓶颈问题的主要途径之一。热休克蛋白（HSP）是一组所有的细胞能在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白，并能对抗更为严重的应激损伤，是一种生物体内源性保护物质[1]。HSPs是细胞暴露在不同应激状态下所诱导合成的一组保守蛋白质，能够提高细胞在应激情况下的生存率[2]，为此，本实验研究尼可地尔预处理诱导内源性热休克蛋白70（HSP70）表达规律，探讨内源性HSP70对离体供心的保护作用，以寻求更为有效的延长供心保存的方法。
1 实验材料与方法
1.1 实验动物及分组。选取24只成年SD大鼠，由华北煤炭医学院动物中心提供，雌雄各半，体重250-350g，随机分为2组，实验组和对照组，每组12只。
1.2 方法。实验组腹腔注射尼可地尔15次（0.1mg/kg，1次/d）；对照组腹腔注射无菌生理盐水15次（0.1ml/kg，1次/d）。两组大鼠分别于第1、3、6、9、15次腹腔注射药物24h后被处死，摘取心脏。
1.3 摘取心脏标本。将上述各实验亚组的实验动物在相对应的时间点称重后，10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔麻醉，游离股静脉，注射肝素0.03mg/kg肝素化，剪开胸骨、心包后暴露心脏，心脏表面放置冰屑，阻断升主动脉，由主动脉根部注射4℃St-Thomas液4～6ml，待心脏完全停搏，心外膜变白后，摘除供心，修剪后放入4℃St-Thomas液中。供心的热缺血时间控制在约1～2min之内。从St-Thomas液中取出心脏，冰生理盐水冲洗干净，迅速沿房室沟剪去心房，沿室间沟剪掉右室保留左室前壁，于前壁长轴处横切3等份，取中间份标本，置于10%中性甲醛4℃固定24h。然后将固定的心肌组织标本，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。全层心肌连续切片，厚度约5μm，用经粘片剂处理过的载玻片捞片，晾干后置于60℃烤箱烘烤3h后行免疫组化S-P法染色。
1.4 HSP70的测定：免疫组化S-P法检测图像分析，细胞核和/或细胞浆内棕黄色沉淀物为阳性信号，每例切片分别取3个高倍视野（×400），用Image-Pro Plus6.0图像分析系统测量组织细胞光密度值（OD）。
1.5 统计学方法：实验中所得数据均以均数±标准差（X±S）表示，以Excel数据库整理后用SPSS13.0统计软件包进行方差分析及相关分析。以α=0.05为检验水准，P<0.05为有统计学差异，P<0.01为统计学差异显著，P>0.05为无统计学差异。
2 结果
对照组注射天数之间心肌内源性HSP70的表达无统计学意义（P>0.05）；尼可地尔预处理能诱导心肌内源性HSP70的表达，表达量在连续给药9次之前随着给药次数的增加呈递增趋势，统计学差异有显著性（P<0.01）；尼可地尔预处理组连续给药9次后，其内源性HSP70的表达量均明显高于前6次（P<0.01）；连续给药15次与给药6次相比，其内源性HSP70表达量有明显差异（P<0.01），但连续给药15次与给药9次相比，其内源性HSP70表达量已无明显增加（P>0.05），连续给药9次后，其内源性HSP70的表达量递增趋势不明显，见表1。
3 讨论
自1967年世界首例人体原位心脏移植成功以来，心脏移植技术业已基本成熟，但供心资源短缺和供心保存效果仍是目前心脏移植面临的两大难题。心脏不仅是高能量依赖的器官，而且具有收缩功能，其生理和功能的特点，决定了供心保护的复杂性和困难性[3-5]。
供心保存（冷缺血）的安全时限一般维持在4～6小时[6]。在心脏移植过程中，供心从切取到移植入受体体内缺血、缺氧时间较长，而且它在植入受体后要尽快恢复功能，立即承载起全身其它脏器的供血功能。如何加强心肌保护，安全、有效地延长供心冷缺血时间，自然就成了影响心脏移植广泛开展的瓶颈问题。供心的保存效果评价及保存时间长短主要取决于心肌缺血性损伤，在供心的离体冷缺血保存期间，良好的心肌保护可大大减少心脏的缺血性损伤。
热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一组高度保守的多肽，普遍存在于生物体内，是目前备受关注的应激蛋白和内源性保护物质。目前认为HSP70心肌保护作用的可能机理[7-9]有以下几种可能：①MC功能：HSP70可通过结合因缺血而受损的蛋白，修复并维持其结构的稳定性，从而减轻受损蛋白的破坏，达到心肌保护的作用。②维护心肌钙离子的稳定：HSP70可通过改善缺血心肌钙通道内环境，减轻心肌钙离子超载，从而提高心肌收缩力，发挥心肌保护作用。③保护心肌线粒体功能、抗凋亡作用：HSP70具有很好的膜稳定性，可通过稳定线粒体保障细胞能量代谢，从而减轻缺血再灌注损伤。④抑制炎性细胞因子释放，发挥非特异性免疫保护作用。HSP70可通过抑制免疫活性因子如IL-1、NF-kB的转录，发挥抗缺血再灌注损伤的效应。⑤调节敏感性钾通道活性，抑制细胞膜上快钠通道开放而抗再灌注心律失常。⑥保护冠状动脉内皮细胞，调节血管平滑肌舒张功能。⑦改善心肌细胞能量代谢。⑧蛋白降解功能。 尼可地尔虽然在结构上属于硝酸盐类，具有硝酸酯样作用，是临床上常用而且安全的药物，用于实验和临床都是安全的。由于其能诱导心肌大量表达HSP70，所以考虑部分心肌保护作用可能是通过内源性HSP70实现的。实验结果显示：尼可地尔注射液是有效的诱导心肌产生内源性HSP70的药物，连续给药9天者，其诱导HSP70的表达量最高（P<0.01），最佳给药时间为连续给药9次。
综上所述，尼可地尔注射液是有效的诱导心肌产生内源性HSP70的药物。尼可地尔诱导的内源性HSP70对大鼠离体心肌保护作用较好，为探讨安全、有效的供心保护方法提供一种新理念和实验依据。
参考文献
[1] Ritossa FM. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila[J]. Experientia， 1962， 18（1）：571-573
[2] Khalil AA，Kabapy NF，Deraz SF，et al.Heat shock proteins in oncology： Diagnostic biomarkers or therapeutic targets[J].Biochim Biophys Acta，2011，1816（ 2） ： 89-104
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[5] 梁胜景，莫安胜，林辉，等.不停跳摘取和保存有完整心包的供心[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（5）：831-834
[6] Jahania MS，Sanchez JA，Narayan P，et al.Heart preservation for transplantation principles and strategies[J].Ann Thorac Surg，1999，68（5）：1983-1987
[7] 郭启仓，赵长全，邬鹏宇等.去甲肾上腺素预处理诱导内源性热休克蛋白70表达对供心保护作用的实验研究.中国医药，2012，07（1）：30-32
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