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摘 要：目的 了解荧光定量PCR用于检测成人社区获得性肺炎患者肺炎支原体意义。方法：对50例社区获得性肺炎患者痰和咽拭及27例无呼吸道感染健康人痰进行荧光定量PCR检测肺炎支原体DNA。结果：健康人27例中8例PCR阳性，CAP患者中45例留痰标本，其中27例做PCR，全部阳性，咽拭49例，36例阳性。以健康人痰中DNA含量高值为感染阈值，最后确定感染比例50%。结论：健康人中上呼吸道存在肺炎支原体DNA，而荧光定量PCR可以作为肺炎支原体检测方法且检测时间短。
关键词：社区获得性肺炎；荧光定量PCR；肺炎支原体；咽拭子；痰
Abstract：ObjectiveTo know the value of flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) that detect the Macoplasma pneumonia of the patiant who are the community acquired pneumonia. Method A total of 50 patients with community-acquired pneumoniae and the heathy control group 27 persons whose respiratory secretion will be check by flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR).Result:Eight of 27 persons in the group is positive .There are 45 persons who generate sputums,27do the flurescence quantitative polymerase chain reaction ,and all are posive. The swab are 49 ,and 36 are posive.Ti is the standard that make sure which is affected by the MP.The threshold is the top of the the health people respiratory secretion quility of the MP DNA.The rate of infection is 50%.Conclusion:There are MP DNA in the upper respiratory tract of the health people.The flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) is a fast and valubale mean to test the DNA of MP.
KeyWords : Fluorescence quantitative polymerase chain reaction；Community acquired pneumoniae；Mycoplasma pneumoniae；Sputum；Swab
肺炎支原体（MP）是社区获得性肺炎重要病原体，所占比例大约10-30%，并呈持续增加的趋势，且目前应用最广泛的β内酰胺类抗生素对肺炎支原体无效，大环内酯类和喹诺酮类虽然对肺炎支原体敏感，然而在亚洲地区肺炎链球菌对大环内酯类耐药率非常高超过50%，而耐喹诺酮的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌比例也在增加，因此在社区获得性肺炎治疗中，联合应用抗生素越来越多。肺炎支原体快速诊断非常重要。
然而肺炎支原体传统诊断方法主要是血清学—IgM或IgG双份血清滴度升高4倍为诊断标准，多用于回顾性诊断，且诊断特异性和敏感性易受免疫力低下和近期患肺炎支原体感染影响。分子生物学是近十几年来发展最迅速学科之一，其核酸扩增技术非常成熟，已应用于肺炎支原体诊断。聚合酶链反应（PCR）就是其中之一，如今在传统PCR技术上出现了更先进PCR技术，如荧光定量PCR，荧光定量PCR是集PCR高敏感性、DNA杂交探针的高特异性和光谱技术的高精确定量为一体，它一般2小时内出结果，为临床早诊断早治疗提供帮助。但肺炎支原体是否是正常人呼吸道定值菌一直存在争议。本实验以正常人呼吸道分泌物及社区获得性肺炎患者痰及咽拭标为本，对标本中肺炎支原体DNA进行定量分析，检验正常人呼吸道是否存在肺炎支原体定植，同时对肺炎支原体肺炎患者进行标本中肺炎支原体DNA定量。
1. 材料与方法：
1.1 研究对象：
2009年5月——2010年1月入住我院呼吸科50例社区获得性肺炎病人（诊断标准参考2006年我国CAP指南标准），其中男24例，女26例，年龄15-82岁。对照组：男14例，女13例，年龄19-75岁，近3个月无呼吸道感染的健康志愿者。
1.2 方法：
1.2.1 标本采集：
咽拭：用无菌拭子擦拭咽后壁，然后浸入1ml无菌生理盐水搅并用力挤压管壁，低倍镜下计数并记录，保存-80度冰箱用以PCR检测。
痰：收集入院时痰标本，低倍镜检是否合格，保存-80度冰箱待检。
对照组只采取咳出的呼吸道分泌物，保存-80度冰箱待检。
1.2.2 PCR过程：
咽拭按肺炎支原体定量PCR试剂盒（试剂盒购于深圳匹基生物有限公司）说明进行操作，患者痰及健康组呼吸道分泌物先用4%氢氧化钠消化，而后按试剂盒说明操作。
2. 统计方法：
实验结果采用SPSS16.0统计分析软件进行数据处理。咽拭的急性期和恢复期运用配对t检验；痰和咽拭阳性率采用独立样本t检验；在肺炎支原体感染组与非肺炎支原体感染组院前抗生素应用、性别、年龄、血沉、影像学、血白细胞等临床特征比较采用卡方和独立样本t检验；对照组采用统计描述；p<0.05认为具有统计学差异。
3. 结果：
咽拭49例，阳性36例，阳性率73.5%，定量8.48×106±1.48×107copies/ml，
痰荧光定量PCR检测24例，阳性率100%，痰MP定量5.94×109±1.51×1010copies/ml。
对照组MP阳性率26.9%，MP量范围0-1.43×106copies/ml，MP感染患者定义为痰DNA大于等于107copies/ml，CAP患者MP感染率为51%。
4. 讨论：
肺炎支原体是目前了解最小的可以在非细胞培养基上生长微生物。由于其DNA含量小，不能形成细胞壁，故对β内酰胺类抗生素不敏感，同时其在CAP中比例越来越大，因此倍受重视。但对于正常人上呼吸道是否有肺炎支原体定植存在争议，以往认为携带率为0-13%[1]，但另一些实验认为正常人呼吸道不存在肺支原体，如瑞典在一个肺炎支原体爆发流行地区，随机选取237名学生，年龄在10-16岁（此年龄段易发肺炎支原体感染）范围，无任何呼吸道感染症状体征。应用实时定量PCR检测，标本咽拭，只有一例阳性，数天后该患出现呼吸道症状，应用大环内酯类药物后好转，在随访中发现肺炎支原体存在时间长短不一，最长达7月，半数超过50天，如果这部分人再出现呼吸道感染，很难区分是否为肺炎支原体感染，如果能定量也许可以区分。我们实验表明有26.9%正常对照组存在肺炎支原体DNA，而对照组近3个月未发生呼吸道感染，我们认为正常人呼吸道存在肺炎支原体。
在对患者标本分析发现痰标本中肺炎支原体全部阳性，咽拭阳性率73.5%，如不定量很难想象全部病人为支原体感染，而且正常对照组中有26.9%为阳性，其中最高肺炎支原体DNA 含量达1.43×106copies/ml，故我们以肺炎患者痰标本中肺炎支原体DNA量大于等于107copies/ml为感染最低值，在确定肺炎支原体感染病人中咽拭最低值以上为肺炎支原体感染，即DNA≥105copies/ml，肺炎支原体总感染率为51%。感染率高于国内相关研究及通常认为肺炎支原体感染率20%左右[2]。这可能因为地区差别，在不同地区、时间和人群中发病率各不相同，多数研究认为发病率约10-20% [3]，但在爆发地区肺炎支原体占CAP病原体可高达65%[4]。我们研究发现在这段时间来我院住院社区获得性肺炎患者，肺炎支原体感染病例比例较大，推测可能这段时间处于流行时节，或者本地区肺炎支原体感染比例原本比其他地区偏高，且在正常人呼吸道发现肺炎支原体DNA。
我们实验发现正常人上呼吸道存在肺炎支原体DNA，但却没有任何全身及呼吸道症状如发热、咳嗽等，不仅正常人，一些受到肺炎支原体感染患者用药后症状缓解但肺炎支原体DNA仍存在，如美国纽约一个肺炎支原体爆发流行地区，给PCR和培养阳性病人阿奇霉素口服3-5天症状缓解，3-6周再查咽拭8/73PCR阳性，3/22培养阳性[5]。这表明肺炎支原体可以无症状存在人呼吸道，是呼吸道定植微生物。故应用PCR检测呼吸道标本肺炎支原体需要定量。我们研究正常对照组人数偏少，如能针对不同季节对较大规模人群进行检测呼吸道肺炎支原体DNA，可以得出本地区正常人群携带肺炎支原体DNA量作为感染阈值，可以作为诊断肺炎支原体感染方法。
参考文献：
1. Anna C Nilsson, Per Bjorkman and Kenneth Persson. Polymerase chain reaction is superior to serology for the diagnosis of acute Mycoplasma pneumoniae infection and reveals a high rate of persistent infection. BMC Microbiology 2008 Jan; 8(93):1-8.
2. 刘铁英.荧光定量PCR对小儿肺炎支原体感染早期诊断价值和临床意义的研究.[D]. 中国优秀硕士学位论文全文数据库,2008; (09).
3.M.Khanna, Fan, K. Pehler-Harrington. The Pneumoplex Assays, a Multiplex PCR Enzyme Hybridization Assay That Allows Simultaneous Detection of Five Organisms, Mycoplasma pneumoniae,Chlamydia(Chlamydophila) pneumoni ae,Legionella pneumophila, Legionell a micdadei, and Bordetella pertussis, and Its Real-Time Counterpart. J Clin Microbiol 2005 Feb; 43(2):565-571.
4. Nam Hee Kim, MD, Jin A Lee, MD, Byung Wook Eun MD, Sun Hee Shin, MD, Eun Hee Chung, MD, Ki Won Park, MD, Eun-Hwa Choi, MD, and Hoan Jong Lee, MD. Comparison of Polymerase Chain Reaction and the Indirect Particle Agglutination Antibody Test for the Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae Pneumonia in Children During Two Outbreaks. Pediatr infect Dis J 2007 May; 26(10):897-903.
5. Alfred L.Waring, Tanya A.Halse, Charles K. Csiza, Cynthia J. Carlyn, Kimberlee Arruda Musser , and Ronald J. Limberger. Develpment of a Genomics-Based PCR Assay for Detection of Mycoplasma pneumoniae in a Large Outbreak in New York State. J Clin Micro 2006 Apr; 39(4):1385-1390.
关键词：社区获得性肺炎；荧光定量PCR；肺炎支原体；咽拭子；痰
Abstract：ObjectiveTo know the value of flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) that detect the Macoplasma pneumonia of the patiant who are the community acquired pneumonia. Method A total of 50 patients with community-acquired pneumoniae and the heathy control group 27 persons whose respiratory secretion will be check by flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR).Result:Eight of 27 persons in the group is positive .There are 45 persons who generate sputums,27do the flurescence quantitative polymerase chain reaction ,and all are posive. The swab are 49 ,and 36 are posive.Ti is the standard that make sure which is affected by the MP.The threshold is the top of the the health people respiratory secretion quility of the MP DNA.The rate of infection is 50%.Conclusion:There are MP DNA in the upper respiratory tract of the health people.The flurescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) is a fast and valubale mean to test the DNA of MP.
KeyWords : Fluorescence quantitative polymerase chain reaction；Community acquired pneumoniae；Mycoplasma pneumoniae；Sputum；Swab
肺炎支原体（MP）是社区获得性肺炎重要病原体，所占比例大约10-30%，并呈持续增加的趋势，且目前应用最广泛的β内酰胺类抗生素对肺炎支原体无效，大环内酯类和喹诺酮类虽然对肺炎支原体敏感，然而在亚洲地区肺炎链球菌对大环内酯类耐药率非常高超过50%，而耐喹诺酮的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌比例也在增加，因此在社区获得性肺炎治疗中，联合应用抗生素越来越多。肺炎支原体快速诊断非常重要。
然而肺炎支原体传统诊断方法主要是血清学—IgM或IgG双份血清滴度升高4倍为诊断标准，多用于回顾性诊断，且诊断特异性和敏感性易受免疫力低下和近期患肺炎支原体感染影响。分子生物学是近十几年来发展最迅速学科之一，其核酸扩增技术非常成熟，已应用于肺炎支原体诊断。聚合酶链反应（PCR）就是其中之一，如今在传统PCR技术上出现了更先进PCR技术，如荧光定量PCR，荧光定量PCR是集PCR高敏感性、DNA杂交探针的高特异性和光谱技术的高精确定量为一体，它一般2小时内出结果，为临床早诊断早治疗提供帮助。但肺炎支原体是否是正常人呼吸道定值菌一直存在争议。本实验以正常人呼吸道分泌物及社区获得性肺炎患者痰及咽拭标为本，对标本中肺炎支原体DNA进行定量分析，检验正常人呼吸道是否存在肺炎支原体定植，同时对肺炎支原体肺炎患者进行标本中肺炎支原体DNA定量。
1. 材料与方法：
1.1 研究对象：
2009年5月——2010年1月入住我院呼吸科50例社区获得性肺炎病人（诊断标准参考2006年我国CAP指南标准），其中男24例，女26例，年龄15-82岁。对照组：男14例，女13例，年龄19-75岁，近3个月无呼吸道感染的健康志愿者。
1.2 方法：
1.2.1 标本采集：
咽拭：用无菌拭子擦拭咽后壁，然后浸入1ml无菌生理盐水搅并用力挤压管壁，低倍镜下计数并记录，保存-80度冰箱用以PCR检测。
痰：收集入院时痰标本，低倍镜检是否合格，保存-80度冰箱待检。
对照组只采取咳出的呼吸道分泌物，保存-80度冰箱待检。
1.2.2 PCR过程：
咽拭按肺炎支原体定量PCR试剂盒（试剂盒购于深圳匹基生物有限公司）说明进行操作，患者痰及健康组呼吸道分泌物先用4%氢氧化钠消化，而后按试剂盒说明操作。
2. 统计方法：
实验结果采用SPSS16.0统计分析软件进行数据处理。咽拭的急性期和恢复期运用配对t检验；痰和咽拭阳性率采用独立样本t检验；在肺炎支原体感染组与非肺炎支原体感染组院前抗生素应用、性别、年龄、血沉、影像学、血白细胞等临床特征比较采用卡方和独立样本t检验；对照组采用统计描述；p<0.05认为具有统计学差异。
3. 结果：
咽拭49例，阳性36例，阳性率73.5%，定量8.48×106±1.48×107copies/ml，
痰荧光定量PCR检测24例，阳性率100%，痰MP定量5.94×109±1.51×1010copies/ml。
对照组MP阳性率26.9%，MP量范围0-1.43×106copies/ml，MP感染患者定义为痰DNA大于等于107copies/ml，CAP患者MP感染率为51%。
4. 讨论：
肺炎支原体是目前了解最小的可以在非细胞培养基上生长微生物。由于其DNA含量小，不能形成细胞壁，故对β内酰胺类抗生素不敏感，同时其在CAP中比例越来越大，因此倍受重视。但对于正常人上呼吸道是否有肺炎支原体定植存在争议，以往认为携带率为0-13%[1]，但另一些实验认为正常人呼吸道不存在肺支原体，如瑞典在一个肺炎支原体爆发流行地区，随机选取237名学生，年龄在10-16岁（此年龄段易发肺炎支原体感染）范围，无任何呼吸道感染症状体征。应用实时定量PCR检测，标本咽拭，只有一例阳性，数天后该患出现呼吸道症状，应用大环内酯类药物后好转，在随访中发现肺炎支原体存在时间长短不一，最长达7月，半数超过50天，如果这部分人再出现呼吸道感染，很难区分是否为肺炎支原体感染，如果能定量也许可以区分。我们实验表明有26.9%正常对照组存在肺炎支原体DNA，而对照组近3个月未发生呼吸道感染，我们认为正常人呼吸道存在肺炎支原体。
在对患者标本分析发现痰标本中肺炎支原体全部阳性，咽拭阳性率73.5%，如不定量很难想象全部病人为支原体感染，而且正常对照组中有26.9%为阳性，其中最高肺炎支原体DNA 含量达1.43×106copies/ml，故我们以肺炎患者痰标本中肺炎支原体DNA量大于等于107copies/ml为感染最低值，在确定肺炎支原体感染病人中咽拭最低值以上为肺炎支原体感染，即DNA≥105copies/ml，肺炎支原体总感染率为51%。感染率高于国内相关研究及通常认为肺炎支原体感染率20%左右[2]。这可能因为地区差别，在不同地区、时间和人群中发病率各不相同，多数研究认为发病率约10-20% [3]，但在爆发地区肺炎支原体占CAP病原体可高达65%[4]。我们研究发现在这段时间来我院住院社区获得性肺炎患者，肺炎支原体感染病例比例较大，推测可能这段时间处于流行时节，或者本地区肺炎支原体感染比例原本比其他地区偏高，且在正常人呼吸道发现肺炎支原体DNA。
我们实验发现正常人上呼吸道存在肺炎支原体DNA，但却没有任何全身及呼吸道症状如发热、咳嗽等，不仅正常人，一些受到肺炎支原体感染患者用药后症状缓解但肺炎支原体DNA仍存在，如美国纽约一个肺炎支原体爆发流行地区，给PCR和培养阳性病人阿奇霉素口服3-5天症状缓解，3-6周再查咽拭8/73PCR阳性，3/22培养阳性[5]。这表明肺炎支原体可以无症状存在人呼吸道，是呼吸道定植微生物。故应用PCR检测呼吸道标本肺炎支原体需要定量。我们研究正常对照组人数偏少，如能针对不同季节对较大规模人群进行检测呼吸道肺炎支原体DNA，可以得出本地区正常人群携带肺炎支原体DNA量作为感染阈值，可以作为诊断肺炎支原体感染方法。
参考文献：
1. Anna C Nilsson, Per Bjorkman and Kenneth Persson. Polymerase chain reaction is superior to serology for the diagnosis of acute Mycoplasma pneumoniae infection and reveals a high rate of persistent infection. BMC Microbiology 2008 Jan; 8(93):1-8.
2. 刘铁英.荧光定量PCR对小儿肺炎支原体感染早期诊断价值和临床意义的研究.[D]. 中国优秀硕士学位论文全文数据库,2008; (09).
3.M.Khanna, Fan, K. Pehler-Harrington. The Pneumoplex Assays, a Multiplex PCR Enzyme Hybridization Assay That Allows Simultaneous Detection of Five Organisms, Mycoplasma pneumoniae,Chlamydia(Chlamydophila) pneumoni ae,Legionella pneumophila, Legionell a micdadei, and Bordetella pertussis, and Its Real-Time Counterpart. J Clin Microbiol 2005 Feb; 43(2):565-571.
4. Nam Hee Kim, MD, Jin A Lee, MD, Byung Wook Eun MD, Sun Hee Shin, MD, Eun Hee Chung, MD, Ki Won Park, MD, Eun-Hwa Choi, MD, and Hoan Jong Lee, MD. Comparison of Polymerase Chain Reaction and the Indirect Particle Agglutination Antibody Test for the Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae Pneumonia in Children During Two Outbreaks. Pediatr infect Dis J 2007 May; 26(10):897-903.
5. Alfred L.Waring, Tanya A.Halse, Charles K. Csiza, Cynthia J. Carlyn, Kimberlee Arruda Musser , and Ronald J. Limberger. Develpment of a Genomics-Based PCR Assay for Detection of Mycoplasma pneumoniae in a Large Outbreak in New York State. J Clin Micro 2006 Apr; 39(4):1385-1390.