论文部分内容阅读
摘要：采用复合酶水解脱脂蚕蛹蛋白制备复合氨基酸，为提高蚕蛹蛋白的水解度，使用Design-Expert软件中的Central Composite Design响应面试验设计法对复合蛋白酶的组成进行优化，建立响应面试验模型。结果表明：水解脱脂蚕蛹蛋白的复合酶的最佳组成是碱性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%、风味蛋白酶19.51%。使用此复合酶配方对脱脂蚕蛹蛋白进行水解，脱脂蚕蛹蛋白的水解度可以达到38.7%。
关键词：脱脂蚕蛹蛋白 复合酶 响应面
中图分类号：Q814.9 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
我国是家蚕的原产地，是世界上最主要的蚕丝生产国，蚕蛹是蚕丝工业的主要副产品，在我国产量巨大。蚕蛹具有很高的营养和药用价值，蚕蛹中蛋白质的含量约占60%左右[1]。脱脂蚕蛹蛋白富含人体所需的18种氨基酸，是一种优质的蛋白质资源，具有很高的经济价值和开发价值。利用脱脂蚕蛹蛋白水解制取的复合氨基酸具有提高免疫力、改善心血管功能、预防心脑血管疾病、补充平衡营养、提高机体各项机能的功效，已被广泛开发成各种类型的营养保健产品[2]。目前，水解脱脂蚕蛹蛋白的方法有酸法、碱法和酶法三种，其中酶法水解具有反应条件温和、不破坏氨基酸、不产生消旋作用、绿色环保等优势被广泛应用。但是酶法最关键的技术问题就是如何提高脱脂蚕蛹蛋白的水解度（DH），提高游离氨基酸的含量。本试验采用复合酶水解制备复合氨基酸，使用Design-Expert软件中的Central Composite Design响应面试验设计法对复合蛋白酶的组成进行优化，以提高脱脂蚕蛹蛋白的水解度。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
脱脂蚕蛹蛋白购自南通福尔生物制品有限公司，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶购自诺维信（中国）生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 复合酶水解脱脂蚕蛹蛋白
准确称取50g脱脂蚕蛹蛋白置于1000mL烧杯中，加入纯水定容至500ml，搅拌均匀，水浴加热至90℃维持10min使蛋白质变性，然后冷却至55℃并维持，加入5%的复合蛋白酶自然pH值酶解10小时。
1.2.2 水解度的测定方法
蛋白水解度（DH）是指蛋白质水解过程中被裂解的肽键数与给定蛋白质的总肽键数之比[3]。蛋白质的肽键断裂后α-氨基氮含量增加，因此可以根据水解过程中生成的α-氨基氮的含量来计算DH。使用甲醛滴定法测定水解后α-氨基氮的量，使用凯氏定氮法测定样品的总氮量[4]，计算DH的公式如下：
1.2.3 响应面优化试验
使用中心组合Central Composite Design （CCD）响应面试验设计法[5]，对复合蛋白酶组成中的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶的配比进行优化。以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶在复合酶组成中的百分比为考察因素，分别以A、B、C表示，则C=100%-A-B，因此以A和B为因素水平、DH为考察指标进行响应面试验设计优化。采用Design-Expert（Version 8.05b）软件对响应面试验得到的数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 响应面优化试验
设定碱性蛋白酶A、中性蛋白酶B的因素水平见表1所示，采用CCD响应面设计法进行优化，试验安排与结果如表2所示。
2.2 回归方程与方差分析
由表3 回归模型的方差分析中可以看出，通过Design-Expert软件计算得到的多元回归方程模型p值=0.0343显著，而失拟项p值=0.9035不显著，说明模型的拟合度较好，能够反映试验的具体水平结果。
2.3 响应因子水平优化
使用Design-Expert软件做出回归模型响应值与因素水平间的响应曲面和等高线图，见图1。
从图1中可以看出，各因素水平对响应值的影响变化趋势及因素水平之间交互作用。从图中可以看出，两个因素水平的响应值对应的曲面和等高线具有最优的响应区域。使用Design-Expert软件进行岭脊分析及回归方程计算，可以得到最优的响应值相对应的因素水平为：碱性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，计算出风味蛋白酶为19.51%。使用该最优的复合酶配方，DH的最大预测值为38.4%。以此试验得到的最优配方进行3次平行验证试验，得到的DH平均值为38.7%，与预测值吻合度较高，说明该响应面模型能够较好的反映实际试验情况，并能准确预测正常的试验结果。
3 结语
以中心组合响应面试验设计法（CCD）对水解脱脂蚕蛹蛋白的复合酶配方进行优化，使用Design-Expert软件对试验数据进行分析处理，建立响应面回归方程并进行方差分析和显著性检验，结果表明模型的拟合度较好，能够较好的预测试验水平。利用该响应面模型预测最优复合酶配方为：碱性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，风味蛋白酶为19.51%。使用最优配方进行三批验证试验，得到的DH平均值为38.7%，与模型预测值极为接近。使用优化后的复合酶配方水解脱脂蚕蛹蛋白，可以得到更高的蛋白水解度。试验证明，使用中心组合响应面试验设计法对水解脱脂蚕蛹蛋白的复合酶配方进行优化是行之有效的。
参考文献
[1]Yang Y， Tang L， Tong L， et al. Silkworms culture as a source of protein for humans in space[J]. Advances in Space Research， 2009， 43（8）：1236–1242.
[2]杨海霞，朱祥瑞，陆洪省.蚕蛹在医学上的应用研究进展[J].科技通报，2002，18（4）：318-322.
[3]Pe?a-Ramos E A， Xiong Y L. Antioxidative Activity of Whey Protein Hydrolysates in a Liposomal System [J]. Journal of Dairy Science， 2001， 84（12）：2577–2583.
[4]大连轻工业学院，华南理工大学.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1994，141-160.
[5]陈斌，庄英萍，郭美锦，等.中心组合设计优化梅岭霉素发酵培养基[J].高技术通讯，2002，12（12）：29-33.
收稿日期：2015-04-20
第一作者简介：周旭波（1981—），男，山东威海人，硕士，工程师，主要研究方向：食品生物技术。
关键词：脱脂蚕蛹蛋白 复合酶 响应面
中图分类号：Q814.9 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
我国是家蚕的原产地，是世界上最主要的蚕丝生产国，蚕蛹是蚕丝工业的主要副产品，在我国产量巨大。蚕蛹具有很高的营养和药用价值，蚕蛹中蛋白质的含量约占60%左右[1]。脱脂蚕蛹蛋白富含人体所需的18种氨基酸，是一种优质的蛋白质资源，具有很高的经济价值和开发价值。利用脱脂蚕蛹蛋白水解制取的复合氨基酸具有提高免疫力、改善心血管功能、预防心脑血管疾病、补充平衡营养、提高机体各项机能的功效，已被广泛开发成各种类型的营养保健产品[2]。目前，水解脱脂蚕蛹蛋白的方法有酸法、碱法和酶法三种，其中酶法水解具有反应条件温和、不破坏氨基酸、不产生消旋作用、绿色环保等优势被广泛应用。但是酶法最关键的技术问题就是如何提高脱脂蚕蛹蛋白的水解度（DH），提高游离氨基酸的含量。本试验采用复合酶水解制备复合氨基酸，使用Design-Expert软件中的Central Composite Design响应面试验设计法对复合蛋白酶的组成进行优化，以提高脱脂蚕蛹蛋白的水解度。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
脱脂蚕蛹蛋白购自南通福尔生物制品有限公司，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶购自诺维信（中国）生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 复合酶水解脱脂蚕蛹蛋白
准确称取50g脱脂蚕蛹蛋白置于1000mL烧杯中，加入纯水定容至500ml，搅拌均匀，水浴加热至90℃维持10min使蛋白质变性，然后冷却至55℃并维持，加入5%的复合蛋白酶自然pH值酶解10小时。
1.2.2 水解度的测定方法
蛋白水解度（DH）是指蛋白质水解过程中被裂解的肽键数与给定蛋白质的总肽键数之比[3]。蛋白质的肽键断裂后α-氨基氮含量增加，因此可以根据水解过程中生成的α-氨基氮的含量来计算DH。使用甲醛滴定法测定水解后α-氨基氮的量，使用凯氏定氮法测定样品的总氮量[4]，计算DH的公式如下：
1.2.3 响应面优化试验
使用中心组合Central Composite Design （CCD）响应面试验设计法[5]，对复合蛋白酶组成中的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶的配比进行优化。以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶在复合酶组成中的百分比为考察因素，分别以A、B、C表示，则C=100%-A-B，因此以A和B为因素水平、DH为考察指标进行响应面试验设计优化。采用Design-Expert（Version 8.05b）软件对响应面试验得到的数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 响应面优化试验
设定碱性蛋白酶A、中性蛋白酶B的因素水平见表1所示，采用CCD响应面设计法进行优化，试验安排与结果如表2所示。
2.2 回归方程与方差分析
由表3 回归模型的方差分析中可以看出，通过Design-Expert软件计算得到的多元回归方程模型p值=0.0343显著，而失拟项p值=0.9035不显著，说明模型的拟合度较好，能够反映试验的具体水平结果。
2.3 响应因子水平优化
使用Design-Expert软件做出回归模型响应值与因素水平间的响应曲面和等高线图，见图1。
从图1中可以看出，各因素水平对响应值的影响变化趋势及因素水平之间交互作用。从图中可以看出，两个因素水平的响应值对应的曲面和等高线具有最优的响应区域。使用Design-Expert软件进行岭脊分析及回归方程计算，可以得到最优的响应值相对应的因素水平为：碱性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，计算出风味蛋白酶为19.51%。使用该最优的复合酶配方，DH的最大预测值为38.4%。以此试验得到的最优配方进行3次平行验证试验，得到的DH平均值为38.7%，与预测值吻合度较高，说明该响应面模型能够较好的反映实际试验情况，并能准确预测正常的试验结果。
3 结语
以中心组合响应面试验设计法（CCD）对水解脱脂蚕蛹蛋白的复合酶配方进行优化，使用Design-Expert软件对试验数据进行分析处理，建立响应面回归方程并进行方差分析和显著性检验，结果表明模型的拟合度较好，能够较好的预测试验水平。利用该响应面模型预测最优复合酶配方为：碱性蛋白酶48.40%、中性蛋白酶32.09%，风味蛋白酶为19.51%。使用最优配方进行三批验证试验，得到的DH平均值为38.7%，与模型预测值极为接近。使用优化后的复合酶配方水解脱脂蚕蛹蛋白，可以得到更高的蛋白水解度。试验证明，使用中心组合响应面试验设计法对水解脱脂蚕蛹蛋白的复合酶配方进行优化是行之有效的。
参考文献
[1]Yang Y， Tang L， Tong L， et al. Silkworms culture as a source of protein for humans in space[J]. Advances in Space Research， 2009， 43（8）：1236–1242.
[2]杨海霞，朱祥瑞，陆洪省.蚕蛹在医学上的应用研究进展[J].科技通报，2002，18（4）：318-322.
[3]Pe?a-Ramos E A， Xiong Y L. Antioxidative Activity of Whey Protein Hydrolysates in a Liposomal System [J]. Journal of Dairy Science， 2001， 84（12）：2577–2583.
[4]大连轻工业学院，华南理工大学.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1994，141-160.
[5]陈斌，庄英萍，郭美锦，等.中心组合设计优化梅岭霉素发酵培养基[J].高技术通讯，2002，12（12）：29-33.
收稿日期：2015-04-20
第一作者简介：周旭波（1981—），男，山东威海人，硕士，工程师，主要研究方向：食品生物技术。