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摘要：副溶血弧菌是一种广泛存在于水生环境中的致病性较强的细菌， 严重危害人和动物健康， 对其进行快速检测研究具有重要的理论和现实意义。本文综述了2016-2018年以来副溶血弧菌在分子生物学、免疫学和电化学等方面的最新检测方法研究进展，旨在为副溶血弧菌的快速检测研究提供参考和理论依据。
关键词：副溶血弧菌；检测方法；免疫检测；电化学检测
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus， VP）是属于弧菌属的一种具有强致病性病的革兰氏阴性细菌，该细菌嗜盐，往往会寄生在河流或海洋环境中的一些浮游生物和水体污染物上。近年来，与副溶血弧菌相关的临床病例检测报告时有报道，而且在世界各地都有过大规模的流行。因此，副溶血弧菌早期检测方法的建立对于预防好控制该菌引起的疾病尤为重要。本文综述了自2016-2018年以来副溶血弧菌在分子生物学、免疫学和电化学等方面的最新检测方法研究进展，旨在为副溶血弧菌的快速检测研究提供参考和理论依据。
1、基于PCR的检测方法
1.1 常规PCR方法
PCR技术是上世纪后期发展起来的热门分子生物学技术之一，该技术已被广泛应用于食品、农业和微生物等领域的快速诊断。目前，基于各种形式的PCR检测技术已用于副溶血弧菌的快速检测。Li等[1]在2016年开发了一种新的PCR技术用于副溶血弧菌的快速、准确检测，该方法以副溶血弧菌的内源性β-内酰胺酶基因blaCARB-17为检测靶标。该基因比传统的tlh，toxR和atpA靶标基因更加保守，检测该菌的特异性达100%。Alaboudi等[2]以副溶血弧菌的gyrB和toxR等基因为靶标，利用PCR技术实现了约旦海岸线的致病性VP的检测与鉴定。Yang等[3]建立了一种新的RPA-IAC的PCR扩增技术，该方法使用重组聚合酶并结合一个内源性扩增对照，在37℃的条件下20 min即可完成扩增，其检测灵敏度可达3×103CFU/mL。
1.2 实时定量PCR方法
实时定量PCR是在PCR过程中加入荧光染料，通过荧光分子信号监测整个PCR进程，并对扩增的靶标进行准确定量分析。Niu等[4]研制了一种实时荧光定量PCR技术，以Vp菌的UreR为检测靶基因，在扩增体系中加入叠氮溴化丙锭抑制死细胞DNA扩增，被应用于同时检测和定量活的致病性和非致病性Vp菌株。Xu等[5]建立一种多重实时定量PCR方法，以groEL， tdh和trh检测模板，实现Vp菌的快速检测与鉴定，该方法的最低检测值为104 CFU/mL。
1.3 PCR整合技术方法
近3年来，越来越多的PCR与其他检测技术相结合，被广泛用于Vp菌的检测分析，具体报道如下。Cheng等[6]利用比色法整合PCR，以tdh，trh，tlh和toxR等毒力基因为检测靶标快速检测Vp菌。Lun等[7]建立了一种基于PCR与免疫磁珠分离现结合的方法检测Vp菌及急性肝坏死疾病（AHPND），该方法的最低检测线为CFU/mL。Machado和Bordalo[8]通过最大可能性PCR（MPN-PCR）同时检测和分析西非几内亚比绍海岸水环境中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌分布，致病性副溶血弧菌的检测丰度为1.2×103 MPN/L。Wang等[9]建立了一种基于纳米金颗粒多重寡核苷酸PCR与生物芯片杂交方法实现同时检测8种食源性致病细菌（含副溶血弧菌），该检测方法的灵敏度为3.3～85 CFU/mL。
1.4 环介导等温扩增方法
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification， LMAP）是一种在恒温条件下快速扩增核酸的基因诊断技术，由于其独特的扩增方式，已被用于各种致病性微生物的快速检测诊断。Shiddique等[10]以副溶血弧菌的高度保守型groEL基因为检测靶标，利用LMAP技术实现副溶血弧菌的检测，其最低检测线为100 fg/每个反应，检测灵敏度比常规PCR要高100倍，在模拟海产品和海水中，最低检测线分别为120 fg和150 fg/每个反应。Pang等[11]設计了一种方法在微流控芯片上利用多色LMAP扩增技术实现副溶血弧菌的定量快速检测，在污染的食品中和细菌没有预富集条件下该方法的最低检测阈值为1×103 CFU/mL。Wang等[12]建立了基于多重限制性内切酶实时环介导的等温扩增技术（Multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermal amplification technology，MERT-LAMP），该方法以副溶血弧菌的toxR和创伤弧菌的rpoS基因为检测靶标，其检测的灵敏度好，是普通PCR和qPCR的100倍以上，在模拟样品中的针对副溶血弧菌的检测阈值为92 CFU/mL。Liu等[13]建立了一种多重环介导等温扩增方法在同一个反应内同时检测和区分沙门氏菌和副溶血弧菌。该方法展示了100%的包容性和排他性，并具有和多重PCR相似的检测阈值。Zhong等[14]以副溶血弧菌tlh，tdh和trh为靶标，设计了6条引物，通过PMA-LMAP等温扩增技术检测并区分处于活的但不可培养状态（Viable but Non-Culturable， VBNC）和死的状态的副溶血弧菌。
2、基于免疫学的检测方法
免疫分析法是建立在抗原抗体特异性结合反应基础上的一种新的检测技术，可以用各种微生物、蛋白质和小分子物质的快速检测分析。Liu等[15]建立了一种高度灵敏的胶体金检测方法，实现了副溶血弧菌的快速检测。该方法特异性强，其检测阈值为1.2×103 CFU/mL。Park和Choi[16]设计了一种基于液相芯片的免疫分析法，可以在45 min内完成对副溶血弧菌进行快速灵敏检测，检测阈值范围为101～105 CFU。Liu等[17]利用具有辣根过氧化物酶活性的MnO2纳米颗粒标记的特异性9肽建立了一种灵敏的比色免疫测定方法，该方法具有较宽的检测范围为20～104 CFU/mL，最低检测线为15 CFU/mL。Fu等[18]建立了一种基于Mn2+介导组装纳米金颗粒的比色免疫分析方法，可以在不富集的条件对海产品中的副溶血弧菌进行快速检测。分析结果中红-紫-蓝颜色的变化反映了不同浓度的副溶血弧菌（10～106 CFU/mL），最低检测线为10 CFU/mL。 3、基于电化学的检测方法
电化学生物传感器是近年来发展起来的一门新型检测技术，由于其良好的敏感性与选择性，在生物检测领域中被广泛应用。Nordin等[19]研發了一种电化学生物传感器，以聚乳酸化金颗粒标记碳电极为检测端，而亚甲蓝试剂作为指示剂，用于检测贝类动物中副溶血弧菌。建立的传感器能够特异地区分完整的、不完整的和错配的寡核苷酸片段，DNA分子的检测范围为2.0×108～2.0×1013 M，最低检测线为2.16 pM。Nordin等[20]于2018年建立了一种电化学DNA生物传感器，用于检测食源致病性副溶血弧菌，该生物传感器体现了良好的特异性和检测应用范围。
4、其他类型检测方法
除了PCR、免疫学和电化学方法以外，也有相关的其他方法被报道用于检测或区分不同类型和状态的副溶血弧菌。Yeung和Thorsen[21]设计并研发了一种新配方的产色琼脂培养基，利用不同弧菌在培养基上的产色差异，可以更加直观和特异的检测和区分副溶血弧菌与其他类型弧菌。该方法是多年来仅有的细菌培养检测文献报道，为弧菌的生化鉴定提供了有利的方法，补充现有生化分析方法的不足。Liu等[22]建立了一种基于CdSe/ZnS量子点与纳米金之间电荷转移的选择性荧光“开关”的副溶血弧菌检测方法，该方法将IgY抗体与金颗粒偶联，借助于量子点与金纳米颗粒之间的电荷转移，从而有效介导荧光信号的“开”与“关”，根据荧光型号的选择性转换，实现副溶血弧菌的快速检测。Yao等[23]设计了一种新型光谱与核酸相结合的技术，在体外利用等温核酸扩增增强物质表面拉曼光谱信号，实现副溶血弧菌的超灵敏检测。该方法的最低检测线为1 CFU/mL，在模拟样品的测试中体现出比较满意的特异性和检测灵敏度。
5、结语与展望
综观以上副溶血弧菌的检测方法，近3年的检测方法中基于PCR的检测仍占据主导地位，而其他方法发展较为迅速，尤其以基于免疫学和电化学方法的新型检测技术不断涌现，在副溶血弧菌检测中发挥越来越重要的作用。随着科学技术的不断发展和副溶血弧菌检测的要求，未来仍然需求多元检测技术的创新与整合，以求开发特异性性更强，检测灵敏度更高和适应性更好的检测新技术，从而真正实现副溶血弧菌快速、高效的灵敏的检测与监测，保障海产品安全与生命健康。
参考文献：
[1]Li RC， et al. Front Microbiol. 2016， 7：44.
[2]Alaboudi AR， et al. J Food Sci. 2016， 81：130-134.
[3]Yang HL， et al. Can J Microbiol. 2018， 64： 223-230.
[4]Niu B， et al. Front Microbiol. 2018， 9：1747.
[5]Xu DH， et al. Can J Microbiol. 2018， 64： 1-7.
[6]Cheng KW， et al. Sensors. 2016， 16：1600.
[7]Lun JS， et al. Aquaculture. 2018， 485： 225-232.
[8]Machado A， and Bordalo AA. EcoHealth. 2016， 13， 339- 349.
[9]Wang XQ， et al. Int J Food Micbiol. 2017， 253： 66-74.
[10]Siddique1MP， et al. Letters in Applied Microbiology. 2017， 65： 106-113.
[11]Pang B， et al. J Agric Food Chem. 2017， 65：11312- 11319.
[12]Wang Y， et al. Molecules 2016， 21：111.
[13]Liu NW， et al. Sci Rep. 2017， 7：45601.
[14]Zhong HM， et al. Microb Pathog. 2017， 111： 362-356.
[15]Liu XF， et al. J Microbiol Meth. 2016， 131：78-84.
[16]Park B， and Choi SJ. Biosen Bioelec. 2017， 90：269-275.
[17]Liu P， et al. Nanoscale. 2018， DOI： 10.1039/c7nr 06633c.
[18]Fu KY， et al. J Agric Food Chem. 2018， 66：9516-9521.
[19]Nordin N， et al. AMB Expr. 2017， 7：41.
[20]Nordin N， et al. J Vis Exp. 2018， 136： e56585.
[21]Yeung M， and Thorsen T. J Vis Exp. 2016， 117：e54493.
[22]Liu YS， et al. Food Control. 2017， 80：380-387.
[23]Yao L， et al. Anal Chem. 2017， 89：9775-9780.
通讯作者：汪世华，男，博士，教授，研究方向： 微生物免疫检测。
基金项目：福建省海洋高新产业发展专项项目（闽海洋高新[2015]26号）。
关键词：副溶血弧菌；检测方法；免疫检测；电化学检测
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus， VP）是属于弧菌属的一种具有强致病性病的革兰氏阴性细菌，该细菌嗜盐，往往会寄生在河流或海洋环境中的一些浮游生物和水体污染物上。近年来，与副溶血弧菌相关的临床病例检测报告时有报道，而且在世界各地都有过大规模的流行。因此，副溶血弧菌早期检测方法的建立对于预防好控制该菌引起的疾病尤为重要。本文综述了自2016-2018年以来副溶血弧菌在分子生物学、免疫学和电化学等方面的最新检测方法研究进展，旨在为副溶血弧菌的快速检测研究提供参考和理论依据。
1、基于PCR的检测方法
1.1 常规PCR方法
PCR技术是上世纪后期发展起来的热门分子生物学技术之一，该技术已被广泛应用于食品、农业和微生物等领域的快速诊断。目前，基于各种形式的PCR检测技术已用于副溶血弧菌的快速检测。Li等[1]在2016年开发了一种新的PCR技术用于副溶血弧菌的快速、准确检测，该方法以副溶血弧菌的内源性β-内酰胺酶基因blaCARB-17为检测靶标。该基因比传统的tlh，toxR和atpA靶标基因更加保守，检测该菌的特异性达100%。Alaboudi等[2]以副溶血弧菌的gyrB和toxR等基因为靶标，利用PCR技术实现了约旦海岸线的致病性VP的检测与鉴定。Yang等[3]建立了一种新的RPA-IAC的PCR扩增技术，该方法使用重组聚合酶并结合一个内源性扩增对照，在37℃的条件下20 min即可完成扩增，其检测灵敏度可达3×103CFU/mL。
1.2 实时定量PCR方法
实时定量PCR是在PCR过程中加入荧光染料，通过荧光分子信号监测整个PCR进程，并对扩增的靶标进行准确定量分析。Niu等[4]研制了一种实时荧光定量PCR技术，以Vp菌的UreR为检测靶基因，在扩增体系中加入叠氮溴化丙锭抑制死细胞DNA扩增，被应用于同时检测和定量活的致病性和非致病性Vp菌株。Xu等[5]建立一种多重实时定量PCR方法，以groEL， tdh和trh检测模板，实现Vp菌的快速检测与鉴定，该方法的最低检测值为104 CFU/mL。
1.3 PCR整合技术方法
近3年来，越来越多的PCR与其他检测技术相结合，被广泛用于Vp菌的检测分析，具体报道如下。Cheng等[6]利用比色法整合PCR，以tdh，trh，tlh和toxR等毒力基因为检测靶标快速检测Vp菌。Lun等[7]建立了一种基于PCR与免疫磁珠分离现结合的方法检测Vp菌及急性肝坏死疾病（AHPND），该方法的最低检测线为CFU/mL。Machado和Bordalo[8]通过最大可能性PCR（MPN-PCR）同时检测和分析西非几内亚比绍海岸水环境中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌分布，致病性副溶血弧菌的检测丰度为1.2×103 MPN/L。Wang等[9]建立了一种基于纳米金颗粒多重寡核苷酸PCR与生物芯片杂交方法实现同时检测8种食源性致病细菌（含副溶血弧菌），该检测方法的灵敏度为3.3～85 CFU/mL。
1.4 环介导等温扩增方法
环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification， LMAP）是一种在恒温条件下快速扩增核酸的基因诊断技术，由于其独特的扩增方式，已被用于各种致病性微生物的快速检测诊断。Shiddique等[10]以副溶血弧菌的高度保守型groEL基因为检测靶标，利用LMAP技术实现副溶血弧菌的检测，其最低检测线为100 fg/每个反应，检测灵敏度比常规PCR要高100倍，在模拟海产品和海水中，最低检测线分别为120 fg和150 fg/每个反应。Pang等[11]設计了一种方法在微流控芯片上利用多色LMAP扩增技术实现副溶血弧菌的定量快速检测，在污染的食品中和细菌没有预富集条件下该方法的最低检测阈值为1×103 CFU/mL。Wang等[12]建立了基于多重限制性内切酶实时环介导的等温扩增技术（Multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermal amplification technology，MERT-LAMP），该方法以副溶血弧菌的toxR和创伤弧菌的rpoS基因为检测靶标，其检测的灵敏度好，是普通PCR和qPCR的100倍以上，在模拟样品中的针对副溶血弧菌的检测阈值为92 CFU/mL。Liu等[13]建立了一种多重环介导等温扩增方法在同一个反应内同时检测和区分沙门氏菌和副溶血弧菌。该方法展示了100%的包容性和排他性，并具有和多重PCR相似的检测阈值。Zhong等[14]以副溶血弧菌tlh，tdh和trh为靶标，设计了6条引物，通过PMA-LMAP等温扩增技术检测并区分处于活的但不可培养状态（Viable but Non-Culturable， VBNC）和死的状态的副溶血弧菌。
2、基于免疫学的检测方法
免疫分析法是建立在抗原抗体特异性结合反应基础上的一种新的检测技术，可以用各种微生物、蛋白质和小分子物质的快速检测分析。Liu等[15]建立了一种高度灵敏的胶体金检测方法，实现了副溶血弧菌的快速检测。该方法特异性强，其检测阈值为1.2×103 CFU/mL。Park和Choi[16]设计了一种基于液相芯片的免疫分析法，可以在45 min内完成对副溶血弧菌进行快速灵敏检测，检测阈值范围为101～105 CFU。Liu等[17]利用具有辣根过氧化物酶活性的MnO2纳米颗粒标记的特异性9肽建立了一种灵敏的比色免疫测定方法，该方法具有较宽的检测范围为20～104 CFU/mL，最低检测线为15 CFU/mL。Fu等[18]建立了一种基于Mn2+介导组装纳米金颗粒的比色免疫分析方法，可以在不富集的条件对海产品中的副溶血弧菌进行快速检测。分析结果中红-紫-蓝颜色的变化反映了不同浓度的副溶血弧菌（10～106 CFU/mL），最低检测线为10 CFU/mL。 3、基于电化学的检测方法
电化学生物传感器是近年来发展起来的一门新型检测技术，由于其良好的敏感性与选择性，在生物检测领域中被广泛应用。Nordin等[19]研發了一种电化学生物传感器，以聚乳酸化金颗粒标记碳电极为检测端，而亚甲蓝试剂作为指示剂，用于检测贝类动物中副溶血弧菌。建立的传感器能够特异地区分完整的、不完整的和错配的寡核苷酸片段，DNA分子的检测范围为2.0×108～2.0×1013 M，最低检测线为2.16 pM。Nordin等[20]于2018年建立了一种电化学DNA生物传感器，用于检测食源致病性副溶血弧菌，该生物传感器体现了良好的特异性和检测应用范围。
4、其他类型检测方法
除了PCR、免疫学和电化学方法以外，也有相关的其他方法被报道用于检测或区分不同类型和状态的副溶血弧菌。Yeung和Thorsen[21]设计并研发了一种新配方的产色琼脂培养基，利用不同弧菌在培养基上的产色差异，可以更加直观和特异的检测和区分副溶血弧菌与其他类型弧菌。该方法是多年来仅有的细菌培养检测文献报道，为弧菌的生化鉴定提供了有利的方法，补充现有生化分析方法的不足。Liu等[22]建立了一种基于CdSe/ZnS量子点与纳米金之间电荷转移的选择性荧光“开关”的副溶血弧菌检测方法，该方法将IgY抗体与金颗粒偶联，借助于量子点与金纳米颗粒之间的电荷转移，从而有效介导荧光信号的“开”与“关”，根据荧光型号的选择性转换，实现副溶血弧菌的快速检测。Yao等[23]设计了一种新型光谱与核酸相结合的技术，在体外利用等温核酸扩增增强物质表面拉曼光谱信号，实现副溶血弧菌的超灵敏检测。该方法的最低检测线为1 CFU/mL，在模拟样品的测试中体现出比较满意的特异性和检测灵敏度。
5、结语与展望
综观以上副溶血弧菌的检测方法，近3年的检测方法中基于PCR的检测仍占据主导地位，而其他方法发展较为迅速，尤其以基于免疫学和电化学方法的新型检测技术不断涌现，在副溶血弧菌检测中发挥越来越重要的作用。随着科学技术的不断发展和副溶血弧菌检测的要求，未来仍然需求多元检测技术的创新与整合，以求开发特异性性更强，检测灵敏度更高和适应性更好的检测新技术，从而真正实现副溶血弧菌快速、高效的灵敏的检测与监测，保障海产品安全与生命健康。
参考文献：
[1]Li RC， et al. Front Microbiol. 2016， 7：44.
[2]Alaboudi AR， et al. J Food Sci. 2016， 81：130-134.
[3]Yang HL， et al. Can J Microbiol. 2018， 64： 223-230.
[4]Niu B， et al. Front Microbiol. 2018， 9：1747.
[5]Xu DH， et al. Can J Microbiol. 2018， 64： 1-7.
[6]Cheng KW， et al. Sensors. 2016， 16：1600.
[7]Lun JS， et al. Aquaculture. 2018， 485： 225-232.
[8]Machado A， and Bordalo AA. EcoHealth. 2016， 13， 339- 349.
[9]Wang XQ， et al. Int J Food Micbiol. 2017， 253： 66-74.
[10]Siddique1MP， et al. Letters in Applied Microbiology. 2017， 65： 106-113.
[11]Pang B， et al. J Agric Food Chem. 2017， 65：11312- 11319.
[12]Wang Y， et al. Molecules 2016， 21：111.
[13]Liu NW， et al. Sci Rep. 2017， 7：45601.
[14]Zhong HM， et al. Microb Pathog. 2017， 111： 362-356.
[15]Liu XF， et al. J Microbiol Meth. 2016， 131：78-84.
[16]Park B， and Choi SJ. Biosen Bioelec. 2017， 90：269-275.
[17]Liu P， et al. Nanoscale. 2018， DOI： 10.1039/c7nr 06633c.
[18]Fu KY， et al. J Agric Food Chem. 2018， 66：9516-9521.
[19]Nordin N， et al. AMB Expr. 2017， 7：41.
[20]Nordin N， et al. J Vis Exp. 2018， 136： e56585.
[21]Yeung M， and Thorsen T. J Vis Exp. 2016， 117：e54493.
[22]Liu YS， et al. Food Control. 2017， 80：380-387.
[23]Yao L， et al. Anal Chem. 2017， 89：9775-9780.
通讯作者：汪世华，男，博士，教授，研究方向： 微生物免疫检测。
基金项目：福建省海洋高新产业发展专项项目（闽海洋高新[2015]26号）。