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摘要：目的 ：研究血根碱联合顺铂对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞体外凋亡的影响。方法：Hoechst33342荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化；印迹杂交法检测A431细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果：荧光染色结果显示血根碱联合顺铂能够诱导A431细胞凋亡，荧光染色可见细胞核明显裂解，细胞凋亡增加；二者联合作用A431细胞后与对照组及单独用药相比Bcl-2蛋白表达显著下调，而Bax蛋白表达显著增强，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：血根碱联合顺铂能诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡，其发生机制可能与其调节Bcl-2、Bax有关。
关键词：肿瘤，鳞状细胞；血根碱；顺铂，A431细胞
Abstract：Objective To study the effect of sanguinarine combined with cisplatin on apoptosis of cutaneous squamous cell carcinoma A431cells.Methods The morphological change of apoptotic cells were observed by Hoechst33342 fluorescent staining.The expression of Bcl-2 and Bax in A431cells was detected by Western blotting.Results Sanguinarine combined with cisplatin could induce A431cells apoptosis，the morphological changes of apoptosis such nuclei fragments was discovered by fluorescence staining. Bcl-2 expression was significantly reduced after Sanguinarine combined with cisplatin on A431 cells，whereas Bax expression markedly enhanced. Conclusion Sanguinarine combined with cisplatin can induce A431 cells apoptosis， significantly inhibit A431cell proliferation. its mechanism may be related to regulating Bcl-2and Bax .
Key Words： Neoplasms， Squamous cell； Sanguinarine； cisplatin； A431cell
根据“2010癌症统计数据”报道，每年的新发皮肤癌（包括鳞状细胞癌）数量远远超过常见其他常见肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠直肠癌等，已经成为了全球范围内的流行病[1]。本课题以人皮肤鳞癌A431细胞为研究对象，采用分子生物学及细胞生物学等相关技术，血根碱联合顺铂对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞体外凋亡的影响从而为两药联合应用治疗皮肤癌提供理论依据。
材料与方法
一、 主要仪器和材料
1.仪器 恒温CO2培养箱（德国Kendro公司）、倒置荧光显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）、垂直电泳槽（上海天能科技公司）、转移电泳槽（大连竞迈生物科技公司）。
2.试剂 人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库公司，RPMI1640培养基购自美国Gbico公司，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Life Technology公司， Hoechst33342购自美国Sigma公司， GAPDH兔多抗购自河北华安生物公司，兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人Bax抗体购自美国Santa Cruz公司。
二、方法
1.细胞培养及分组 A431细胞常规培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，实验选用对数生长期细胞，分为阴性对照组、实验组包括血根碱组（SA）3μg/ml，顺铂组（DDP）2μg/ml，血根碱（SA）3μg/ml+顺铂组（DDP）2μg/ml。
2. Hoechst33342检测A431细胞凋亡形态变化 取对数生长期的 A431 细胞，用 2.5%胰蛋白酶消化后，计数，细胞浓度为 2×105/ml，以 500μl /孔 接种于24孔板，分组同上。次日，实验组加入药物，培养48h。培养结束后，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入5μg/ml Hoechst33342染色液，37℃孵育10 min。PBS洗涤一次，荧光显微镜观察拍照。
3.免疫杂交印迹法检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化：收集细胞，提取各组细胞总蛋白；每组各取50μ蛋白样品进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜， 5%脱脂奶粉-TBST中封闭1h。洗膜后加入一抗，室温孵育10min，放4℃过夜。洗膜5次后加入二抗（山羊抗兔IgG，按1∶1000 稀释） 室温下结合2h，洗膜5次后显色，显色适当时间后双蒸水冲洗终止反应，自然晾干，MicroTEK扫描后用ImageJ图像分析软件分析目的蛋白灰度值。
4.统计学处理 结果以±s表示。分析方法采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用q检验（SNK），利用SPSS13.0统计学软件进行分析，P<0.05差异有统计学意义。
结 果
1、 Hoechst33342检测A431细胞凋亡形态变化
荧光显微镜下发现空白对照组A431细胞核完整，呈圆形，荧光染色较浅且较均匀，无凋亡形态学改变；血根碱组、顺铂组及血根碱联合顺铂组均出现不同程度的A431细胞核裂解甚至呈碎块状致密染色的凋亡形态学变化，而血根碱联合顺铂组细胞较其他三组细胞凋亡数目明显增多（图1）。 2、 免疫杂交印迹检测结果
免疫印迹检测（表1）表明，各组作用于A431细胞48h后，血根碱联合顺铂组与其它三组相比Bcl-2灰度值明显降低、而Bax灰度值增高，差异有统计学意义（P<0.01）。
图1 A431细胞凋亡细胞凋亡形态学改变
（Hoechst33342荧光染色）
表 1 血根碱联合顺铂对A431细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响（n=3，±S）
Note： Bcl-2：*vs control group P<0.001， # vs SA group 、DDP group P<0.01， Bax：* vs control group P<0.001，# SA group 、DDP group P<0.01， Bax/Bcl-2： vs control group P<0.001， # vs SA group 、DDP group P<0.01.
讨 论
细胞的增殖与凋亡失衡时导致肿瘤细胞恶化的主要原因，所以细胞凋亡是机体维持自身平衡的一种基本生理机制[2]，细胞凋亡受多种基因的调控，其中Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡调控中起重要作用。其主要作用是抑制细胞凋亡和延长细胞存活。Bcl-2蛋白家族可分为两类：一类为抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-xL等，一类为促凋亡蛋白，如Bax和Bid等。Bax是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白[3]，因此，Bcl-2/Bax比值决定了细胞接受信号后细胞是否进入凋亡状态。Bax与Bcl-2的相对比例决定了细胞是否发生凋亡，比例降低细胞不易发生凋亡，而比例增高则导致细胞凋亡[4] 。
以往，化疗药物在皮肤肿瘤的非手术治疗中占有主要作用，但其在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，具有细胞毒作用的无选择性，从而对宿主全身会产生毒副作用，成为化疗实施障碍，从而很大程度上影响肿瘤治疗的效[5]。因此除了寻找高效低毒的新化疗药物外，通过联合其他抗肿瘤天然活性成分提高化疗效果，同时降低药物剂量减少对正常细胞的毒性越来越引起国内外研究者的重视。血根碱已作为中药用于治疗各种疾病，其中包括肿瘤，目前，已通过一系列试验证明血根碱能够诱导癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的增殖[6-8]。本研究发现，血根碱联合顺铂作用于A431细胞48小时后，与阴性对照组、血根碱组及顺铂组相比，细胞明显出现核裂解，且细胞数量明显减少。免疫印迹结果显示，血根碱联合顺铂作用于A431细胞后，促凋亡蛋白Bax较其他三组表达明显增强，而抗凋亡蛋白Bcl-2正好相反，其表达与其他三组相比明显减少，血根碱联合顺铂Bax/Bcl-2比值与其他三组相比差异有统计学意义（P<0.01）。表明血根碱联合顺铂诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡作用与Bcl-2表达降低和Bax表达增强有关，其具体机制尚待进一步研究。
参考文献：
1.Jemal A，Siegel R，Xu J et al.Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.
2.Blagosklonny MV. Prospective strategies to enforce selectively cell death in cancer cells. Oncogene， 2004， 23（16）：2967-2975.
3.Guo B ，Zhai D ，Cabezas E， et al. Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with
Bax activation [J]. Nature ，2003，423（6938）：456-461.
4.Xie Z， Koyama T， Suzuki J， et al. Coronary reperfusion following ischemia： different expression of bcl- 2 and bax protein， and cardiomyocyte apoptosis. Jpn Heart J， 2001， 42（6）： 759-770.
5. 吕圭源.药理学[M].北京：中国中医药出版社，2003：400-404.
6. Park H，Bergeron E，Senta H，et a1.Sanguinarine induces apoptosis of human osteosarcoma cells through the extrinsic and intrinsic pathways.Biochem Biophys Res Commun，2010，399（3）：446-451.
7.Slunskd Z，Gelnarov6 E，Hammerov J，et a1.Effect of quaternary henzo[c]phenanthridine alkaloids sanguilutine and chelilutine on normal and cancer ceils.Toxicol in Vitro，2010，
24（3）：697-706.
8.Larsson DE，Wickstrfm M，Hassan S，et a1.The cytotoxic agents NSC-95397，brefeldin A，bortezomib and sanguinarine induce apoptosis in neuroendocrine tumors in Vitro. Anticancer Res，2010，30（1）：149-156.
关键词：肿瘤，鳞状细胞；血根碱；顺铂，A431细胞
Abstract：Objective To study the effect of sanguinarine combined with cisplatin on apoptosis of cutaneous squamous cell carcinoma A431cells.Methods The morphological change of apoptotic cells were observed by Hoechst33342 fluorescent staining.The expression of Bcl-2 and Bax in A431cells was detected by Western blotting.Results Sanguinarine combined with cisplatin could induce A431cells apoptosis，the morphological changes of apoptosis such nuclei fragments was discovered by fluorescence staining. Bcl-2 expression was significantly reduced after Sanguinarine combined with cisplatin on A431 cells，whereas Bax expression markedly enhanced. Conclusion Sanguinarine combined with cisplatin can induce A431 cells apoptosis， significantly inhibit A431cell proliferation. its mechanism may be related to regulating Bcl-2and Bax .
Key Words： Neoplasms， Squamous cell； Sanguinarine； cisplatin； A431cell
根据“2010癌症统计数据”报道，每年的新发皮肤癌（包括鳞状细胞癌）数量远远超过常见其他常见肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠直肠癌等，已经成为了全球范围内的流行病[1]。本课题以人皮肤鳞癌A431细胞为研究对象，采用分子生物学及细胞生物学等相关技术，血根碱联合顺铂对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞体外凋亡的影响从而为两药联合应用治疗皮肤癌提供理论依据。
材料与方法
一、 主要仪器和材料
1.仪器 恒温CO2培养箱（德国Kendro公司）、倒置荧光显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）、垂直电泳槽（上海天能科技公司）、转移电泳槽（大连竞迈生物科技公司）。
2.试剂 人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库公司，RPMI1640培养基购自美国Gbico公司，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Life Technology公司， Hoechst33342购自美国Sigma公司， GAPDH兔多抗购自河北华安生物公司，兔抗人Bcl-2抗体、兔抗人Bax抗体购自美国Santa Cruz公司。
二、方法
1.细胞培养及分组 A431细胞常规培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中，实验选用对数生长期细胞，分为阴性对照组、实验组包括血根碱组（SA）3μg/ml，顺铂组（DDP）2μg/ml，血根碱（SA）3μg/ml+顺铂组（DDP）2μg/ml。
2. Hoechst33342检测A431细胞凋亡形态变化 取对数生长期的 A431 细胞，用 2.5%胰蛋白酶消化后，计数，细胞浓度为 2×105/ml，以 500μl /孔 接种于24孔板，分组同上。次日，实验组加入药物，培养48h。培养结束后，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入5μg/ml Hoechst33342染色液，37℃孵育10 min。PBS洗涤一次，荧光显微镜观察拍照。
3.免疫杂交印迹法检测Bcl-2、Bax蛋白表达变化：收集细胞，提取各组细胞总蛋白；每组各取50μ蛋白样品进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜， 5%脱脂奶粉-TBST中封闭1h。洗膜后加入一抗，室温孵育10min，放4℃过夜。洗膜5次后加入二抗（山羊抗兔IgG，按1∶1000 稀释） 室温下结合2h，洗膜5次后显色，显色适当时间后双蒸水冲洗终止反应，自然晾干，MicroTEK扫描后用ImageJ图像分析软件分析目的蛋白灰度值。
4.统计学处理 结果以±s表示。分析方法采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用q检验（SNK），利用SPSS13.0统计学软件进行分析，P<0.05差异有统计学意义。
结 果
1、 Hoechst33342检测A431细胞凋亡形态变化
荧光显微镜下发现空白对照组A431细胞核完整，呈圆形，荧光染色较浅且较均匀，无凋亡形态学改变；血根碱组、顺铂组及血根碱联合顺铂组均出现不同程度的A431细胞核裂解甚至呈碎块状致密染色的凋亡形态学变化，而血根碱联合顺铂组细胞较其他三组细胞凋亡数目明显增多（图1）。 2、 免疫杂交印迹检测结果
免疫印迹检测（表1）表明，各组作用于A431细胞48h后，血根碱联合顺铂组与其它三组相比Bcl-2灰度值明显降低、而Bax灰度值增高，差异有统计学意义（P<0.01）。
图1 A431细胞凋亡细胞凋亡形态学改变
（Hoechst33342荧光染色）
表 1 血根碱联合顺铂对A431细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响（n=3，±S）
Note： Bcl-2：*vs control group P<0.001， # vs SA group 、DDP group P<0.01， Bax：* vs control group P<0.001，# SA group 、DDP group P<0.01， Bax/Bcl-2： vs control group P<0.001， # vs SA group 、DDP group P<0.01.
讨 论
细胞的增殖与凋亡失衡时导致肿瘤细胞恶化的主要原因，所以细胞凋亡是机体维持自身平衡的一种基本生理机制[2]，细胞凋亡受多种基因的调控，其中Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡调控中起重要作用。其主要作用是抑制细胞凋亡和延长细胞存活。Bcl-2蛋白家族可分为两类：一类为抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-xL等，一类为促凋亡蛋白，如Bax和Bid等。Bax是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白[3]，因此，Bcl-2/Bax比值决定了细胞接受信号后细胞是否进入凋亡状态。Bax与Bcl-2的相对比例决定了细胞是否发生凋亡，比例降低细胞不易发生凋亡，而比例增高则导致细胞凋亡[4] 。
以往，化疗药物在皮肤肿瘤的非手术治疗中占有主要作用，但其在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，具有细胞毒作用的无选择性，从而对宿主全身会产生毒副作用，成为化疗实施障碍，从而很大程度上影响肿瘤治疗的效[5]。因此除了寻找高效低毒的新化疗药物外，通过联合其他抗肿瘤天然活性成分提高化疗效果，同时降低药物剂量减少对正常细胞的毒性越来越引起国内外研究者的重视。血根碱已作为中药用于治疗各种疾病，其中包括肿瘤，目前，已通过一系列试验证明血根碱能够诱导癌细胞的凋亡，抑制癌细胞的增殖[6-8]。本研究发现，血根碱联合顺铂作用于A431细胞48小时后，与阴性对照组、血根碱组及顺铂组相比，细胞明显出现核裂解，且细胞数量明显减少。免疫印迹结果显示，血根碱联合顺铂作用于A431细胞后，促凋亡蛋白Bax较其他三组表达明显增强，而抗凋亡蛋白Bcl-2正好相反，其表达与其他三组相比明显减少，血根碱联合顺铂Bax/Bcl-2比值与其他三组相比差异有统计学意义（P<0.01）。表明血根碱联合顺铂诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡作用与Bcl-2表达降低和Bax表达增强有关，其具体机制尚待进一步研究。
参考文献：
1.Jemal A，Siegel R，Xu J et al.Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.
2.Blagosklonny MV. Prospective strategies to enforce selectively cell death in cancer cells. Oncogene， 2004， 23（16）：2967-2975.
3.Guo B ，Zhai D ，Cabezas E， et al. Humanin peptide suppresses apoptosis by interfering with
Bax activation [J]. Nature ，2003，423（6938）：456-461.
4.Xie Z， Koyama T， Suzuki J， et al. Coronary reperfusion following ischemia： different expression of bcl- 2 and bax protein， and cardiomyocyte apoptosis. Jpn Heart J， 2001， 42（6）： 759-770.
5. 吕圭源.药理学[M].北京：中国中医药出版社，2003：400-404.
6. Park H，Bergeron E，Senta H，et a1.Sanguinarine induces apoptosis of human osteosarcoma cells through the extrinsic and intrinsic pathways.Biochem Biophys Res Commun，2010，399（3）：446-451.
7.Slunskd Z，Gelnarov6 E，Hammerov J，et a1.Effect of quaternary henzo[c]phenanthridine alkaloids sanguilutine and chelilutine on normal and cancer ceils.Toxicol in Vitro，2010，
24（3）：697-706.
8.Larsson DE，Wickstrfm M，Hassan S，et a1.The cytotoxic agents NSC-95397，brefeldin A，bortezomib and sanguinarine induce apoptosis in neuroendocrine tumors in Vitro. Anticancer Res，2010，30（1）：149-156.