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摘要：采用PCR-DGGE技术是解析石油污染土壤中细菌群落结构特征的常用方法，本文通过对PCR-DGGE技术及其应用过程的介绍，从而对其主题进行了阐释。
关键词：石油污染；土壤；细菌群落；结构特征；
分类号：X172
石油规模化、机械化的开采、加工及运输等，为我国的经济发展做出了突出的贡献，但与此同时，也导致了许多环境污染问题，其中，土壤的石油污染尤为严重。在土壤受到石油的污染之后， 会影响到空气质量、地下水、周围河流以及农作物生长等。为此， 针对石油污染问题以及对其有效修复已成为人们关注的重点，而采取何种安全又有效的修复技术是当前面临的难题。在各种修复技术中，微生物修复技术以其处理费用低、无污染及可进行原位处理等特点，在当前的应用市场具有广阔的发展前景。
近些年来， 分子生物学技术日新月异，分子生态学技术也随之而发展起来，如 T-RFLP分析技术、SSCP技术以及 DGGE技术等都得到了广泛的应用，这些技术均可用于原位解析微生物群落结构，其中DGGE 技术，它操作简单、检测效率较高、准确率较高以及重现性强， 因此，该种技术在微生物种群分析上具有最为广泛的应用。分子生态学技术的原理是：用变性剂梯度把长度相等但序列不同的双链DNA 片段进行区分。下面以PCR-DGGE技术为例，对石油污染土壤中细菌群落的结构特征进行剖析， 定性地分析石油污染的过程所带来的细菌群落演替的规律， 从而为生物修复技术的开发提供理论依据。
1.采用PCR-DGGE技术所需的材料及方法。
（1）采集各地石油污染土壤样品。
石油污染土壤样品主要采自于大庆油田，在某采油区的几个采油井附近进行取样，该地区的土壤都受到不同程度的石油污染，将采集到的土壤样品用冷藏盒进行保存，尽快带回实验室， 把相同井距的样品分别取1克进行均匀混合，提取DNA后再进行分析。DNA提取后，将其沉淀溶解于60微升 T E 缓冲液之中。再把粗提液放入浓度为1%的琼脂糖凝胶之中，再进行电泳50 分钟，最终提取纯化的基因组DNA。
（2）PCR 扩增。
使用细菌16S rRNA 基因V3 区通用引物，反向引物534R 的5ˊ端带有GC 夹。PCR 扩增采用的是50 LL 扩增体系，PCR 扩增程序是：94 摄氏度预变性10 分钟；接以94摄氏度变性1分钟， 55摄氏度退火1分钟，72摄氏度延伸1.5摄氏度。进行循环完后， 72摄氏度延伸10分钟。当PCR程序完成后，取适量跑琼脂糖凝胶进行电泳， 以检查产物的纯度与浓度。
（3）DGGE 的分析条件。
PCR 产物的分离采用基因突变检测系统，制备浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶，而变性剂的浓度从40% 至60% 梯度变化，再在60摄氏度、电压150V电泳7.5 小时， 再进行银染。经过染色之后的凝胶再用透射扫描仪来获取其图谱。
（4）条带切取和克隆测序的分析。
将图谱上的目的条带切取后，将其溶解并以此作为模板，再次进行PCR 扩增并且采用同等的引物， 并切胶回收扩增产物，再与pMD18 载体相连接，利用氨苄抗性及蓝白斑筛以获取阳性克隆，再进行测序和对比，把石油污染土壤样品之中的16S rRNA 基因序列分类及分析。
2.结果与讨论。
（1）基因组的提取和PCR 扩增结果。
DGGE 分析结果的准确与否和基因组DNA 的质量有着直接的关系，提取来的DNA粗提液利用试剂盒进行纯化，以降低或者消除腐殖酸及离子等杂质， 从而避免其中的杂质对后续PCR 扩增的过程有抑制。通过对提取的土壤基因组DGGE 图谱和土壤基因组PCR 扩增DGGE 图谱的仔细分析，提取到的土壤基因组DNA 是一个清晰的条带，没有降解， 没有RNA 污染。PCR 的扩增采用细菌通用引物338F 及534R，其扩增的主要目的片段在于16S rRNA 基因上的V3 区，属于高变区， 在此区域内，细菌的繁殖进化中碱基序列和结构变化大， 被认为是分离鉴定细菌的特征性区域。
（2）DGGE 指纹图谱的分析。
绘制石油污染土样的PCR-DGGE 图谱，再对图谱进行分析。因为PCR-DGGE 技术的分辨能力有限， 而土壤之中的微生物具有多样性，单一性微生物种群的数量较少， 所以，在没有受到石油污染的土样中，能够检测到的微生物种群的条带数比较少。如果石油渗入到土壤之中，就会导致土壤中的微生物种群的相应地改变。大多数细菌的碳源都是石油烃类污染物，且随着时间的推移，很多的细菌开始对石油烃进行降解， 并慢慢繁殖，进而成为这个区域内土壤之中的优势菌。但不可忽视的是， 细菌对石油烃类底物有一定的耐受阈值， 不同种类的细菌，其耐受阈值也是不同的，为此，在不同石油污染程度的土壤之中， 细菌群落的结构特征也存在很大的差异性。具体而言，细菌群落结构特征差异性可用主成分分析对其进行比较，将细菌群落结构相似性较高的归为一类，进而对其进行分析。
（3）条带的克隆测序与分析。
通过分析PCR-DGGE 图谱条带的亮度及数量，可以获得细菌群落结构特征的的宏观信息，之后，还要对图谱上的条带进行克隆测序与分析，以进一步地确定图谱中的条带所表示的细菌的种属。此定性分析的方法可以让我们更多地了解土样中的细菌种群的组成与演替的过程。将图谱上的条带进行切取后，分别对其进行克隆测序， 再把测序的结果和Genbank之中已知的序列进行Blast 比对， 由对比后的结果来看， 条带3 与假单胞菌Pseudomonas sp的相似性较高，但假单胞菌这种分类过于宽泛， 不同菌种对于底物的选择也有很大差异， 在该试验的土壤之中， 假单胞菌在石油渗入到土壤中后，其数量大幅度减少，由此可见，石油烃对此菌株的毒性比较严重。此外，条带4 序列为根瘤菌属细菌， 条带4在石油的重污染区域仍有一定的浓度， 可见，其不仅利用固氮作用，也在利用石油作为它的碳源去繁殖。条带5 与Methy libium sp具体很高的相似性， 由条带4 与条带5 的图谱可推知，这两种细菌都对石油有耐受范围， 如果超过这个范围的极限， 菌株的生长与繁殖就会受到一定的抑制；条带6 序列同菌株Tr i chococcus f loccul if ormi s的 相似性同样很高，且在所有的采样点中都有出现，所以，此菌株属于土壤之中的土著类群。
3.结束语。
PCR-DGGE 技术是解析石油污染土壤中细菌群落结构特征的重要方法和手段，对于研究其细菌群落的结构特征有重要意义。由上述实验可见，在石油污染土壤后，一些种菌的数量会显著减少，某些种菌在石油污染土壤后，其数量又会大幅度增加；而一些菌属对石油有一定的耐受阈值，因此，多出现于有一定石油含量的土壤之中；除此以外，还有一些种菌是土壤中的土著类群，那么，石油污染对该种菌的生长和繁殖的影响比较小。在不同石油污染程度的土壤中，其细菌群落结构的特征也不同，目前，关于此问题的研究已取得了一定的成果，但仍然需要后人更进一步地探索。
参考文献：
[1]陆秀君，郭书海，孙清，梁成华. 石油污染土壤的修复技术研究现状及展望[J]. 沈阳农业大学学报， 2003，（01） .
[2]李慧，张颖，苏振成，徐慧，KRAVCHENKO Irina，张成刚. 沈抚石油污水灌区稻田土壤细菌遗传多样性——16S rDNA-PCR-DGGE分析[J]. 土壤学报， 2006，（06） .
[3]齐建超，郭婷，王贺，张清敏. 微生态菌剂联合修复石油污染土壤生态系统[A]. 微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C]， 2008 .
关键词：石油污染；土壤；细菌群落；结构特征；
分类号：X172
石油规模化、机械化的开采、加工及运输等，为我国的经济发展做出了突出的贡献，但与此同时，也导致了许多环境污染问题，其中，土壤的石油污染尤为严重。在土壤受到石油的污染之后， 会影响到空气质量、地下水、周围河流以及农作物生长等。为此， 针对石油污染问题以及对其有效修复已成为人们关注的重点，而采取何种安全又有效的修复技术是当前面临的难题。在各种修复技术中，微生物修复技术以其处理费用低、无污染及可进行原位处理等特点，在当前的应用市场具有广阔的发展前景。
近些年来， 分子生物学技术日新月异，分子生态学技术也随之而发展起来，如 T-RFLP分析技术、SSCP技术以及 DGGE技术等都得到了广泛的应用，这些技术均可用于原位解析微生物群落结构，其中DGGE 技术，它操作简单、检测效率较高、准确率较高以及重现性强， 因此，该种技术在微生物种群分析上具有最为广泛的应用。分子生态学技术的原理是：用变性剂梯度把长度相等但序列不同的双链DNA 片段进行区分。下面以PCR-DGGE技术为例，对石油污染土壤中细菌群落的结构特征进行剖析， 定性地分析石油污染的过程所带来的细菌群落演替的规律， 从而为生物修复技术的开发提供理论依据。
1.采用PCR-DGGE技术所需的材料及方法。
（1）采集各地石油污染土壤样品。
石油污染土壤样品主要采自于大庆油田，在某采油区的几个采油井附近进行取样，该地区的土壤都受到不同程度的石油污染，将采集到的土壤样品用冷藏盒进行保存，尽快带回实验室， 把相同井距的样品分别取1克进行均匀混合，提取DNA后再进行分析。DNA提取后，将其沉淀溶解于60微升 T E 缓冲液之中。再把粗提液放入浓度为1%的琼脂糖凝胶之中，再进行电泳50 分钟，最终提取纯化的基因组DNA。
（2）PCR 扩增。
使用细菌16S rRNA 基因V3 区通用引物，反向引物534R 的5ˊ端带有GC 夹。PCR 扩增采用的是50 LL 扩增体系，PCR 扩增程序是：94 摄氏度预变性10 分钟；接以94摄氏度变性1分钟， 55摄氏度退火1分钟，72摄氏度延伸1.5摄氏度。进行循环完后， 72摄氏度延伸10分钟。当PCR程序完成后，取适量跑琼脂糖凝胶进行电泳， 以检查产物的纯度与浓度。
（3）DGGE 的分析条件。
PCR 产物的分离采用基因突变检测系统，制备浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶，而变性剂的浓度从40% 至60% 梯度变化，再在60摄氏度、电压150V电泳7.5 小时， 再进行银染。经过染色之后的凝胶再用透射扫描仪来获取其图谱。
（4）条带切取和克隆测序的分析。
将图谱上的目的条带切取后，将其溶解并以此作为模板，再次进行PCR 扩增并且采用同等的引物， 并切胶回收扩增产物，再与pMD18 载体相连接，利用氨苄抗性及蓝白斑筛以获取阳性克隆，再进行测序和对比，把石油污染土壤样品之中的16S rRNA 基因序列分类及分析。
2.结果与讨论。
（1）基因组的提取和PCR 扩增结果。
DGGE 分析结果的准确与否和基因组DNA 的质量有着直接的关系，提取来的DNA粗提液利用试剂盒进行纯化，以降低或者消除腐殖酸及离子等杂质， 从而避免其中的杂质对后续PCR 扩增的过程有抑制。通过对提取的土壤基因组DGGE 图谱和土壤基因组PCR 扩增DGGE 图谱的仔细分析，提取到的土壤基因组DNA 是一个清晰的条带，没有降解， 没有RNA 污染。PCR 的扩增采用细菌通用引物338F 及534R，其扩增的主要目的片段在于16S rRNA 基因上的V3 区，属于高变区， 在此区域内，细菌的繁殖进化中碱基序列和结构变化大， 被认为是分离鉴定细菌的特征性区域。
（2）DGGE 指纹图谱的分析。
绘制石油污染土样的PCR-DGGE 图谱，再对图谱进行分析。因为PCR-DGGE 技术的分辨能力有限， 而土壤之中的微生物具有多样性，单一性微生物种群的数量较少， 所以，在没有受到石油污染的土样中，能够检测到的微生物种群的条带数比较少。如果石油渗入到土壤之中，就会导致土壤中的微生物种群的相应地改变。大多数细菌的碳源都是石油烃类污染物，且随着时间的推移，很多的细菌开始对石油烃进行降解， 并慢慢繁殖，进而成为这个区域内土壤之中的优势菌。但不可忽视的是， 细菌对石油烃类底物有一定的耐受阈值， 不同种类的细菌，其耐受阈值也是不同的，为此，在不同石油污染程度的土壤之中， 细菌群落的结构特征也存在很大的差异性。具体而言，细菌群落结构特征差异性可用主成分分析对其进行比较，将细菌群落结构相似性较高的归为一类，进而对其进行分析。
（3）条带的克隆测序与分析。
通过分析PCR-DGGE 图谱条带的亮度及数量，可以获得细菌群落结构特征的的宏观信息，之后，还要对图谱上的条带进行克隆测序与分析，以进一步地确定图谱中的条带所表示的细菌的种属。此定性分析的方法可以让我们更多地了解土样中的细菌种群的组成与演替的过程。将图谱上的条带进行切取后，分别对其进行克隆测序， 再把测序的结果和Genbank之中已知的序列进行Blast 比对， 由对比后的结果来看， 条带3 与假单胞菌Pseudomonas sp的相似性较高，但假单胞菌这种分类过于宽泛， 不同菌种对于底物的选择也有很大差异， 在该试验的土壤之中， 假单胞菌在石油渗入到土壤中后，其数量大幅度减少，由此可见，石油烃对此菌株的毒性比较严重。此外，条带4 序列为根瘤菌属细菌， 条带4在石油的重污染区域仍有一定的浓度， 可见，其不仅利用固氮作用，也在利用石油作为它的碳源去繁殖。条带5 与Methy libium sp具体很高的相似性， 由条带4 与条带5 的图谱可推知，这两种细菌都对石油有耐受范围， 如果超过这个范围的极限， 菌株的生长与繁殖就会受到一定的抑制；条带6 序列同菌株Tr i chococcus f loccul if ormi s的 相似性同样很高，且在所有的采样点中都有出现，所以，此菌株属于土壤之中的土著类群。
3.结束语。
PCR-DGGE 技术是解析石油污染土壤中细菌群落结构特征的重要方法和手段，对于研究其细菌群落的结构特征有重要意义。由上述实验可见，在石油污染土壤后，一些种菌的数量会显著减少，某些种菌在石油污染土壤后，其数量又会大幅度增加；而一些菌属对石油有一定的耐受阈值，因此，多出现于有一定石油含量的土壤之中；除此以外，还有一些种菌是土壤中的土著类群，那么，石油污染对该种菌的生长和繁殖的影响比较小。在不同石油污染程度的土壤中，其细菌群落结构的特征也不同，目前，关于此问题的研究已取得了一定的成果，但仍然需要后人更进一步地探索。
参考文献：
[1]陆秀君，郭书海，孙清，梁成华. 石油污染土壤的修复技术研究现状及展望[J]. 沈阳农业大学学报， 2003，（01） .
[2]李慧，张颖，苏振成，徐慧，KRAVCHENKO Irina，张成刚. 沈抚石油污水灌区稻田土壤细菌遗传多样性——16S rDNA-PCR-DGGE分析[J]. 土壤学报， 2006，（06） .
[3]齐建超，郭婷，王贺，张清敏. 微生态菌剂联合修复石油污染土壤生态系统[A]. 微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C]， 2008 .