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摘 要：本文综述了分子标记技术及其应用于瓜类蔬菜种质资源亲缘关系和遗传多样性分析、分子标记辅助选择、品种纯度鉴定、遗传图谱构建及基因定位等方面的研究进展，对目前分子标记技术应用于瓜类蔬菜育种中存在的问题进行了探讨，并对其应用前景做了展望，以期为今后瓜类蔬菜高效分子育种技术的建立提供参考。
关键词：瓜类蔬菜；分子标记技术；辅助育种；研究进展
中图分类号：S642.036 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0136-04
瓜类蔬菜在我国蔬菜生产中占有重要地位。分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传多态性的直接反映[1]。分子标记技术的出现，使植物育种的“间接选择”成为可能，大大提高了遗传分析的准确性和选育品种的有效性[2]。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，分子标记技术在蔬菜育种中的作用越来越受到重视[3]。本文综述了几种常见的分子标记技术在瓜类蔬菜育种中的研究进展，以期为瓜类蔬菜高效分子育种体系的建立提供参考。
1 分子标记技术种类
Bostein等（1980）最早利用限制性长度片段多态性 （Restriction fragment length polymorphism， RFLP）作为遗传标记构建了遗传连锁图谱，开创了直接利用DNA多态性发展遗传标记的新阶段[4]。DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化[9]，与传统的遗传标记相比具有许多特殊优点，如不受环境、季节限制，不受个体发育阶段影响，不存在基因表达与否的问题等[5～8]。现已发展出十几种DNA标记技术，概括起来主要包括以下3种类型：
①基于杂交的分子标记技术，如 RFLP。
②基于PCR扩增的分子标记技术，它又分为两类。一是仅基于PCR的扩增方法。它包括使用随机引物（Arbitrary primer） 进行扩增的随机扩增多态性DNA技术（Random amplified polymorphic DNA， RAPD），和采用特定引物或引物对扩增的标记技术，主要有序列特异性扩增区 （Sequence characterized amplified region， SCAR）、微卫星DNA （ Microsatellite DNA），又称简单重复序列 （Simple sequence repeat， SSR）和ISSR（Inter simple sequence repeat）等。其中SCAR属于位点特异的PCR标记方法，其他则属于多位点标记方法，检测区域均与微卫星序列有关。二是PCR与酶切相结合的方法。主要指扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism， AFLP）和酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence， CAPS）两类。其中AFLP 是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增；而CAPS是先扩增，再酶切扩增片段，检测酶切片段的长度多态性。
③基于DNA序列和芯片的分子标记技术，如单核苷酸多态性 （Single nucleotide polymorphism， SNP）。
每种DNA 分子标记技术都具有各自的优缺点和适用性，需要研究者结合实际加以选择。
2 分子标记技术在瓜类蔬菜育种中的应用
分子标记技术主要涉及分子遗传图谱的构建、遗传多样性研究、品种纯度鉴定、亲缘关系鉴定、重要基因的标记与定位、分子标记辅助选择、基因的图位克隆等许多领域，其在瓜类蔬菜育种中的应用，提高了瓜类蔬菜作物的育种效率[10]。
2.1 种质资源亲缘关系和遗传多样性的研究
随着生物学尤其是遗传学和分子生物学的发展，植物遗传多样性的检测水平获得了显著提高，从形态学、细胞学（染色体）、生理生化水平逐步发展到分子水平，为物种起源、品种分类的研究提供了理论依据。分子标记技术检测的是基因组水平上的差异，非常稳定，不受外界环境影响，并且通过对遗传图谱的分析，可以准确区分品种间的差异，为种质资源亲缘关系和遗传多样性的分析提供可靠、有效的工具[11～13]。
赵娜等[14]采用61对SSR特异引物对46份厚皮甜瓜进行UPGMA聚类分析，结果显示，供试材料的遗传相似系数达到了0.62，说明这46份厚皮甜瓜材料的亲缘关系非常近。盛云燕等[15]在甜瓜SSR标记遗传多样性研究中，采用50对SSR特异引物对46份甜瓜栽培品种（系）进行分析，有48对引物扩增出谱带，其中46对具有多样性，结果显示，运用分子标记技术可以提高甜瓜栽培品种多样性分析的准确性。尚建立等[16]以我国西瓜、甜瓜种质资源中期库内1 200份西瓜种质为材料，对果实重量、果肉颜色、中心糖、种子千粒重等12项主要植物学性状进行遗传多样性和相关性分析。高山等[17]采用RAPD和ISSR分子标记技术对38份苦瓜种质进行遗传多样性分析，两种标记技术都能扩增出各自的多态性谱带，反应了苦瓜种质丰富的遗传多样性；其中RAPD标记将供试苦瓜种质划分为3个类群6组，与张长远等[18]对苦瓜亲缘关系的RAPD分析结论基本一致。杨衍等[19]对36份苦瓜种质资源利用AFLP技术进行遗传多样性和亲缘关系评价分析，将供试材料分为2个类群。Gaikwad等[20]也做过类似的相关研究。李晓慧等[21]利用SRAP分子标记对西瓜品种的多态性进行分析，探讨了西瓜的遗传多样性。段会军等[22]对50个西瓜枯萎病菌株的RAPD、ISSR和AFLP分子标记的研究揭示了西瓜枯萎病菌株分子水平上的遗传多样性，同时也说明了西瓜枯萎病遗传分化较大，存在着比较丰富的遗传变异，为西瓜抗病育种和西瓜枯萎病的综合防治提供理论依据。Paris等[23]利用AFLP、ISSR、SSR标记对45个南瓜品种进行研究，将其分为3个亚种。黄秀丽[24]利用种子蛋白质与几种同工酶电泳及RAPD标记对南瓜属4个栽培种间的亲缘关系进行探讨，结果表明中国南瓜与美洲南瓜亲缘关系最近，与印度南瓜关系较远。 2.2 分子标记辅助选择
传统的育种主要依赖于植株的表现型进行选择，环境条件、基因间的互作、基因型与环境互作等多种因素都会影响表现型选择效率，一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。分子标记辅助选择育种可以对作物在早期进行快速、准确的选择，减少育种过程的盲目性和周期性，提高育种效率，加速育种进程[25，26]。
王怀松等[27]以抗病的7-2和感病的7-1、7-3杂交组合与分离群体为试材进行了甜瓜抗白粉病连锁分子标记研究，建立了甜瓜抗白粉病AFLP标记技术体系，找到了一个与甜瓜白粉病抗病基因紧密连锁的AFLP标记：M60/E25-520。马鸿艳[28]利用获得的2对SSR标记结合田间接种鉴定对101份甜瓜种质资源进行抗白粉病筛选，结果显示，引物SSR04816平均符合率为81.4%，引物SSR01498平均符合率为68.6%，引物SSR04816鉴定结果符合率大于80%，可用于分子标记辅助选择育种。张晓波等[29]对甜瓜雌雄异花同株和雄全同株材料间杂交后代及回交后代的花性型分离进行研究，在F2代中利用SSR技术对单性花基因进行了分子标记筛选并找到了与该基因连锁的标记，遗传距离分别为7.0 cM和29.5 cM。孙晓丹等[30]利用形态学观察、经典遗传性状分析、AFLP分子标记等技术在形态学和分子标记水平上研究了黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律，开发出实用有效的分子标记，提高了黄瓜育种工作效率。为了加速培育出人们青睐的优质黄皮西瓜，王日升等[31]以西瓜黑皮母本（H97）和黄皮父本（2605）构建的BC1分离群体为材料，利用RAPD技术筛选出一个与黄皮性状基因连锁的RAPD标记AI09-1500，重组率为17.2%。
2.3 品种纯度鉴定
种子质量的高低影响农作物产量及品质，在种子质量检验的各个指标中，品种纯度检验尤为重要。传统的品种纯度鉴定费时费力且受环境、人为等多方面影响。分子标记技术以种子的DNA作为检测对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测，且不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题[32]。
羊杏平等[33]利用RAPD和ISSR两种分子标记技术鉴定西瓜杂交种抗病苏蜜和苏蜜5号的遗传纯度，成功发现了能用于纯度检测的7个RAPD母本特异引物、4个RAPD父本特异引物、2个ISSR母本特异引物及2个RAPD父母本特异标记共显性引物，对于西瓜杂交种的遗传纯度检测具有重要意义。李菊芬等[34]应用RAPD、ISSR和SSR三种分子标记技术对西瓜杂交种“东方红1号”和“8424”纯度的快速鉴定进行了研究，在73对SSR引物中，各筛选到3对多态性引物能够用于杂交种纯度鉴定，且SSR鉴定结果与大田形态鉴定结果一致。李菊芬等[35]研究还显示，应用筛选出的SSR引物组合，能够有效地检测出混杂在杂交种中的母本自交系种子，也能检测出其它不明来源花粉所导致的生物性混杂，提高了甜瓜杂交种纯度检测结果的准确度。
2.4 遗传图谱构建及基因定位
分子遗传图谱是指以遗传标记为基础的染色体或基因位点的相对位置的线性排列图[36]。遗传图谱的构建是瓜类蔬菜分子研究的重要内容之一，是基因定位与图位克隆及基因组结构与功能研究的基础，为分子标记辅助育种提供依据。
路绪强等[37]利用甜瓜全雌系W1998（无雄花）与雌雄异花同株品系3-2-2（有雄花）杂交，F1代全部为雌雄异花同株，以F2代为试材，采用SSR分子标记构建甜瓜遗传图谱，并定位了甜瓜控制雄花分化基因（An），进一步完善了甜瓜性别分化的表达机制。王军辉等[38]利用抗黄瓜花叶病毒（CMV）的黄瓜材料F-3和感CMV的黄瓜材料HZL04-1为亲本，构建了包含190个F2代的遗传作物群体，采用SSR、EST-SSR、SCAR三种分子标记技术进行遗传连锁分析，构建了黄瓜遗传连锁图谱，该图谱为黄瓜抗CMV的QTL定位奠定了基础。易克等[39]以野生西瓜种质PI296341为父本，普通西瓜97103为母本，获得F8的重组自交系群体，通过16个SSR引物和5个ISSR引物组成的48个标记构建了一个包括11个连锁群的分子图谱，总长度为558.1 cM，平均图距为11.9 cM。Yeboah等[40]利用SRAP和ISSR标记技术对黄瓜F2代群体进行标记分析，共获得109个多态性标记，构建了包含7个连锁群的连锁图谱，基因位点平均间距为16 cM。尽管分子标记在瓜类作物的遗传图谱和基因定位方面取得了很大进展，但是饱和度高且能满足育种需求的遗传图谱尚未见报道。
3 问题与展望
近几年来，分子标记技术不断发展、完善，但是利用分子标记大规模培育瓜类蔬菜作物优良品系或品种的愿望仍未实现。多数研究仍处在起步阶段，缺乏合理有效的试验依据；瓜类作物的遗传图谱饱和度较低，无法满足育种的需求[41]；与传统的形态鉴别方法相比，DNA分子标记技术所需仪器精密、药品昂贵、程序复杂，难以普及和应用[26]。因此，今后应充分利用不同分子标记技术加快遗传图谱的整合工作，提高其饱和度，完善高密度遗传标记连锁图谱的构建，同时开展新型分子标记的研究，寻求经济实用的新性状标记，并与常规育种有效结合起来，为瓜类蔬菜育种提供更好的服务。
参 考 文 献：
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关键词：瓜类蔬菜；分子标记技术；辅助育种；研究进展
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瓜类蔬菜在我国蔬菜生产中占有重要地位。分子标记是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传多态性的直接反映[1]。分子标记技术的出现，使植物育种的“间接选择”成为可能，大大提高了遗传分析的准确性和选育品种的有效性[2]。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，分子标记技术在蔬菜育种中的作用越来越受到重视[3]。本文综述了几种常见的分子标记技术在瓜类蔬菜育种中的研究进展，以期为瓜类蔬菜高效分子育种体系的建立提供参考。
1 分子标记技术种类
Bostein等（1980）最早利用限制性长度片段多态性 （Restriction fragment length polymorphism， RFLP）作为遗传标记构建了遗传连锁图谱，开创了直接利用DNA多态性发展遗传标记的新阶段[4]。DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化[9]，与传统的遗传标记相比具有许多特殊优点，如不受环境、季节限制，不受个体发育阶段影响，不存在基因表达与否的问题等[5～8]。现已发展出十几种DNA标记技术，概括起来主要包括以下3种类型：
①基于杂交的分子标记技术，如 RFLP。
②基于PCR扩增的分子标记技术，它又分为两类。一是仅基于PCR的扩增方法。它包括使用随机引物（Arbitrary primer） 进行扩增的随机扩增多态性DNA技术（Random amplified polymorphic DNA， RAPD），和采用特定引物或引物对扩增的标记技术，主要有序列特异性扩增区 （Sequence characterized amplified region， SCAR）、微卫星DNA （ Microsatellite DNA），又称简单重复序列 （Simple sequence repeat， SSR）和ISSR（Inter simple sequence repeat）等。其中SCAR属于位点特异的PCR标记方法，其他则属于多位点标记方法，检测区域均与微卫星序列有关。二是PCR与酶切相结合的方法。主要指扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism， AFLP）和酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence， CAPS）两类。其中AFLP 是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增；而CAPS是先扩增，再酶切扩增片段，检测酶切片段的长度多态性。
③基于DNA序列和芯片的分子标记技术，如单核苷酸多态性 （Single nucleotide polymorphism， SNP）。
每种DNA 分子标记技术都具有各自的优缺点和适用性，需要研究者结合实际加以选择。
2 分子标记技术在瓜类蔬菜育种中的应用
分子标记技术主要涉及分子遗传图谱的构建、遗传多样性研究、品种纯度鉴定、亲缘关系鉴定、重要基因的标记与定位、分子标记辅助选择、基因的图位克隆等许多领域，其在瓜类蔬菜育种中的应用，提高了瓜类蔬菜作物的育种效率[10]。
2.1 种质资源亲缘关系和遗传多样性的研究
随着生物学尤其是遗传学和分子生物学的发展，植物遗传多样性的检测水平获得了显著提高，从形态学、细胞学（染色体）、生理生化水平逐步发展到分子水平，为物种起源、品种分类的研究提供了理论依据。分子标记技术检测的是基因组水平上的差异，非常稳定，不受外界环境影响，并且通过对遗传图谱的分析，可以准确区分品种间的差异，为种质资源亲缘关系和遗传多样性的分析提供可靠、有效的工具[11～13]。
赵娜等[14]采用61对SSR特异引物对46份厚皮甜瓜进行UPGMA聚类分析，结果显示，供试材料的遗传相似系数达到了0.62，说明这46份厚皮甜瓜材料的亲缘关系非常近。盛云燕等[15]在甜瓜SSR标记遗传多样性研究中，采用50对SSR特异引物对46份甜瓜栽培品种（系）进行分析，有48对引物扩增出谱带，其中46对具有多样性，结果显示，运用分子标记技术可以提高甜瓜栽培品种多样性分析的准确性。尚建立等[16]以我国西瓜、甜瓜种质资源中期库内1 200份西瓜种质为材料，对果实重量、果肉颜色、中心糖、种子千粒重等12项主要植物学性状进行遗传多样性和相关性分析。高山等[17]采用RAPD和ISSR分子标记技术对38份苦瓜种质进行遗传多样性分析，两种标记技术都能扩增出各自的多态性谱带，反应了苦瓜种质丰富的遗传多样性；其中RAPD标记将供试苦瓜种质划分为3个类群6组，与张长远等[18]对苦瓜亲缘关系的RAPD分析结论基本一致。杨衍等[19]对36份苦瓜种质资源利用AFLP技术进行遗传多样性和亲缘关系评价分析，将供试材料分为2个类群。Gaikwad等[20]也做过类似的相关研究。李晓慧等[21]利用SRAP分子标记对西瓜品种的多态性进行分析，探讨了西瓜的遗传多样性。段会军等[22]对50个西瓜枯萎病菌株的RAPD、ISSR和AFLP分子标记的研究揭示了西瓜枯萎病菌株分子水平上的遗传多样性，同时也说明了西瓜枯萎病遗传分化较大，存在着比较丰富的遗传变异，为西瓜抗病育种和西瓜枯萎病的综合防治提供理论依据。Paris等[23]利用AFLP、ISSR、SSR标记对45个南瓜品种进行研究，将其分为3个亚种。黄秀丽[24]利用种子蛋白质与几种同工酶电泳及RAPD标记对南瓜属4个栽培种间的亲缘关系进行探讨，结果表明中国南瓜与美洲南瓜亲缘关系最近，与印度南瓜关系较远。 2.2 分子标记辅助选择
传统的育种主要依赖于植株的表现型进行选择，环境条件、基因间的互作、基因型与环境互作等多种因素都会影响表现型选择效率，一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。如何提高选择效率，是育种工作的关键。分子标记辅助选择育种可以对作物在早期进行快速、准确的选择，减少育种过程的盲目性和周期性，提高育种效率，加速育种进程[25，26]。
王怀松等[27]以抗病的7-2和感病的7-1、7-3杂交组合与分离群体为试材进行了甜瓜抗白粉病连锁分子标记研究，建立了甜瓜抗白粉病AFLP标记技术体系，找到了一个与甜瓜白粉病抗病基因紧密连锁的AFLP标记：M60/E25-520。马鸿艳[28]利用获得的2对SSR标记结合田间接种鉴定对101份甜瓜种质资源进行抗白粉病筛选，结果显示，引物SSR04816平均符合率为81.4%，引物SSR01498平均符合率为68.6%，引物SSR04816鉴定结果符合率大于80%，可用于分子标记辅助选择育种。张晓波等[29]对甜瓜雌雄异花同株和雄全同株材料间杂交后代及回交后代的花性型分离进行研究，在F2代中利用SSR技术对单性花基因进行了分子标记筛选并找到了与该基因连锁的标记，遗传距离分别为7.0 cM和29.5 cM。孙晓丹等[30]利用形态学观察、经典遗传性状分析、AFLP分子标记等技术在形态学和分子标记水平上研究了黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律，开发出实用有效的分子标记，提高了黄瓜育种工作效率。为了加速培育出人们青睐的优质黄皮西瓜，王日升等[31]以西瓜黑皮母本（H97）和黄皮父本（2605）构建的BC1分离群体为材料，利用RAPD技术筛选出一个与黄皮性状基因连锁的RAPD标记AI09-1500，重组率为17.2%。
2.3 品种纯度鉴定
种子质量的高低影响农作物产量及品质，在种子质量检验的各个指标中，品种纯度检验尤为重要。传统的品种纯度鉴定费时费力且受环境、人为等多方面影响。分子标记技术以种子的DNA作为检测对象，在植物体的各个组织、各个发育时期均可检测，且不受季节、环境限制，不存在是否表达的问题[32]。
羊杏平等[33]利用RAPD和ISSR两种分子标记技术鉴定西瓜杂交种抗病苏蜜和苏蜜5号的遗传纯度，成功发现了能用于纯度检测的7个RAPD母本特异引物、4个RAPD父本特异引物、2个ISSR母本特异引物及2个RAPD父母本特异标记共显性引物，对于西瓜杂交种的遗传纯度检测具有重要意义。李菊芬等[34]应用RAPD、ISSR和SSR三种分子标记技术对西瓜杂交种“东方红1号”和“8424”纯度的快速鉴定进行了研究，在73对SSR引物中，各筛选到3对多态性引物能够用于杂交种纯度鉴定，且SSR鉴定结果与大田形态鉴定结果一致。李菊芬等[35]研究还显示，应用筛选出的SSR引物组合，能够有效地检测出混杂在杂交种中的母本自交系种子，也能检测出其它不明来源花粉所导致的生物性混杂，提高了甜瓜杂交种纯度检测结果的准确度。
2.4 遗传图谱构建及基因定位
分子遗传图谱是指以遗传标记为基础的染色体或基因位点的相对位置的线性排列图[36]。遗传图谱的构建是瓜类蔬菜分子研究的重要内容之一，是基因定位与图位克隆及基因组结构与功能研究的基础，为分子标记辅助育种提供依据。
路绪强等[37]利用甜瓜全雌系W1998（无雄花）与雌雄异花同株品系3-2-2（有雄花）杂交，F1代全部为雌雄异花同株，以F2代为试材，采用SSR分子标记构建甜瓜遗传图谱，并定位了甜瓜控制雄花分化基因（An），进一步完善了甜瓜性别分化的表达机制。王军辉等[38]利用抗黄瓜花叶病毒（CMV）的黄瓜材料F-3和感CMV的黄瓜材料HZL04-1为亲本，构建了包含190个F2代的遗传作物群体，采用SSR、EST-SSR、SCAR三种分子标记技术进行遗传连锁分析，构建了黄瓜遗传连锁图谱，该图谱为黄瓜抗CMV的QTL定位奠定了基础。易克等[39]以野生西瓜种质PI296341为父本，普通西瓜97103为母本，获得F8的重组自交系群体，通过16个SSR引物和5个ISSR引物组成的48个标记构建了一个包括11个连锁群的分子图谱，总长度为558.1 cM，平均图距为11.9 cM。Yeboah等[40]利用SRAP和ISSR标记技术对黄瓜F2代群体进行标记分析，共获得109个多态性标记，构建了包含7个连锁群的连锁图谱，基因位点平均间距为16 cM。尽管分子标记在瓜类作物的遗传图谱和基因定位方面取得了很大进展，但是饱和度高且能满足育种需求的遗传图谱尚未见报道。
3 问题与展望
近几年来，分子标记技术不断发展、完善，但是利用分子标记大规模培育瓜类蔬菜作物优良品系或品种的愿望仍未实现。多数研究仍处在起步阶段，缺乏合理有效的试验依据；瓜类作物的遗传图谱饱和度较低，无法满足育种的需求[41]；与传统的形态鉴别方法相比，DNA分子标记技术所需仪器精密、药品昂贵、程序复杂，难以普及和应用[26]。因此，今后应充分利用不同分子标记技术加快遗传图谱的整合工作，提高其饱和度，完善高密度遗传标记连锁图谱的构建，同时开展新型分子标记的研究，寻求经济实用的新性状标记，并与常规育种有效结合起来，为瓜类蔬菜育种提供更好的服务。
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