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【中图分类号】R379【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2015）8
【关键词】 中性红染色 抗真菌药 微生物敏感性试验
抗真菌药物的体外药敏试验是用作测定抗真菌药物对致病真菌的敏感程度、杀灭效力的。试验结果对指导临床用药有重要价值。体外药敏试验常规测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（minimumfugicide concentration，MFC）。但常规方法比较费时费事。由于中性红染色法只能使活的真菌着色[1，2]，因此我们试用中性红染色法与常规MFC测定法进行对照，一方面试验中性红染色在药敏中的应用，用于测定药物的MFC值；另一方面测定抗真菌药物的MIC和MFC值的浓度差别，测试抗真菌药物的效力。
材料和方法
一、材料
1.药品来源：（1）特比萘芬（terbinafine），山东齐鲁药厂提供。（2）伊曲康唑（itraconazole）纯品，西安杨森药厂提供。
2.菌株来源：北京医科大学第一医院皮肤科真菌和真菌病研究中心临床分离致病菌株，共22株皮肤癣菌。其中红色毛癣菌（T.rubrum）10株，须癣毛癣菌（T.mentagrophytes）8株，石膏小孢子菌（M.gypseum）3株，犬小孢子菌（M.canis）1株。
3.培养基：（1）固体沙氏培养基。（2）改良沙氏液体培养基：称取葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，加入蒸馏水1 000 ml中高压蒸气灭菌，4℃贮存备用。
二、方法
1.制备药物保存液和工作液：称取特比萘芬、伊曲康唑各12.8 mg，分别溶于1 ml的纯二甲基亚砜（DMSO）中即成12.8 mg/ml，贮存在4"C冰箱内备用a试验时用50%DMSO稀释1 000倍，进一步用基础液体培养基分别稀释200倍和25倍，即试验工作浓度分别为特比萘芬0.064μg/ml，伊曲康唑0.512μg/mL。
2.菌悬液制备：试验前用固体沙氏培养基传代培养，25℃孵育10-14天，选生长良好的
3.中性红染液配制：用pH 6.8 PBS缓冲液充分溶解，浓度为0.01%。
4.液体培养基稀释法[3]：用改良沙氏液体培养基为基础培养基，采用液体培养基倍比稀释法体外测定特比萘芬和伊曲康唑的抗菌力，设无药对照和溶媒对照，接种菌浓度为1×105CFU/ml，25℃孵育5天观察。
5.MIC值的判定方法：肉眼下液体培养基清亮与药物空白对照相同为抑菌即阴性，液体培养基混浊或有菌膜生长，则为无抑菌作用即阳性。
6.常规法测MFC值：取50μl有抑菌作用的菌悬液接种于固体沙氏培养基上。25℃孵育5天观察，有菌落生长为阳性，无菌落生长为阴性即杀菌。
7.中性红染色法：取10ul上述菌悬液置于载玻片上，与0.01%中性红10μl充分混匀后，显微镜检查，茵丝和孢子内出现橘红颗粒染料为活性真菌。无染色颗粒的真菌即为死菌。
结果
22株皮肤癣菌体外MIC值测定：特比萘芬MIC值范围0.001-0.008μg/ml，其中红色毛癣菌最低为0.001～0.002μg/ml。伊曲康唑MIC值范围0.001-0.016μg/ml，其中红色毛癣菌最低为0.001～0.002μg/ml，与特比萘芬相同（附表）。
22株皮肤癣菌体外MFC值测定：特比萘芬MFC值0.001～0.008μg/ml，其中红色毛癣菌为0.001-002μg /ml，与MIC值相同，具有杀菌作用。伊曲康唑MFC值0.016～0.256μg/ml，其中红色毛癣菌为0.016～0。064μg /ml。中性红染色法和常规培养法测的MFC值一致（附表）。
讨论
特比萘芬是丙烯胺类广谱抗真菌药，它能抑制真菌细胞的角鲨烯环氧化酶，使麦角固醇合成受阻，以及角鲨烯聚集，从而影响真菌细胞膜功能，起到抗菌作用。通过特比萘芬对22株皮肤癣菌体外抗菌试验结果示MIC值与MFC值相同为0.001～0.008μg/ml，说明特比萘芬有抑菌和杀菌的双重作用。中性红染色法和常规法测定的MFC值相同。
伊曲康唑是三氮唑类衍生物，通过抑制真菌细胞的麦角甾醇的合成而发挥抗菌作用。通过伊曲康唑对22株皮肤癣荫体外抗菌试验MIC值0.001～0.016μg/ml，而MFC值0.016-0.256μg/ml，二者差别不大，证明伊曲康唑对皮肤癣菌也有抑菌和杀菌的效应，中性红染色法与常规法测定的MFC值大致相同。
中性红分子量是288，为水溶性染料，能通过有活性的细胞膜贮存在溶酶体内，染色阳性；当细胞膜和溶酶体膜破坏后，不能摄取染料，因此无活性细胞染色阴性。将中性红染色法应用于真菌研究，已有文献报道【1.2】。我们应用中性红染色法体外测定特比萘芬、伊曲康唑对22株皮肤癣菌抗菌效力，结果表明：应用中性红染色法评价真菌活性和抗真菌药效试验方便、快捷，尤在测定抗真菌药物对真菌的MFc值方面较常规方法优越。由于例数太少，结果只能参考.今后要扩大菌量、菌种，以得出确切的结论。 l
参考文献
1. Naka W，Hanyaku H，Tajima S，et al.Application of neutral red staining for evaluation of theviability of dermatophytes and candida in human skin scales.J Med Vet Mycol，1994，32：34-36.
【关键词】 中性红染色 抗真菌药 微生物敏感性试验
抗真菌药物的体外药敏试验是用作测定抗真菌药物对致病真菌的敏感程度、杀灭效力的。试验结果对指导临床用药有重要价值。体外药敏试验常规测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（minimumfugicide concentration，MFC）。但常规方法比较费时费事。由于中性红染色法只能使活的真菌着色[1，2]，因此我们试用中性红染色法与常规MFC测定法进行对照，一方面试验中性红染色在药敏中的应用，用于测定药物的MFC值；另一方面测定抗真菌药物的MIC和MFC值的浓度差别，测试抗真菌药物的效力。
材料和方法
一、材料
1.药品来源：（1）特比萘芬（terbinafine），山东齐鲁药厂提供。（2）伊曲康唑（itraconazole）纯品，西安杨森药厂提供。
2.菌株来源：北京医科大学第一医院皮肤科真菌和真菌病研究中心临床分离致病菌株，共22株皮肤癣菌。其中红色毛癣菌（T.rubrum）10株，须癣毛癣菌（T.mentagrophytes）8株，石膏小孢子菌（M.gypseum）3株，犬小孢子菌（M.canis）1株。
3.培养基：（1）固体沙氏培养基。（2）改良沙氏液体培养基：称取葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，加入蒸馏水1 000 ml中高压蒸气灭菌，4℃贮存备用。
二、方法
1.制备药物保存液和工作液：称取特比萘芬、伊曲康唑各12.8 mg，分别溶于1 ml的纯二甲基亚砜（DMSO）中即成12.8 mg/ml，贮存在4"C冰箱内备用a试验时用50%DMSO稀释1 000倍，进一步用基础液体培养基分别稀释200倍和25倍，即试验工作浓度分别为特比萘芬0.064μg/ml，伊曲康唑0.512μg/mL。
2.菌悬液制备：试验前用固体沙氏培养基传代培养，25℃孵育10-14天，选生长良好的
3.中性红染液配制：用pH 6.8 PBS缓冲液充分溶解，浓度为0.01%。
4.液体培养基稀释法[3]：用改良沙氏液体培养基为基础培养基，采用液体培养基倍比稀释法体外测定特比萘芬和伊曲康唑的抗菌力，设无药对照和溶媒对照，接种菌浓度为1×105CFU/ml，25℃孵育5天观察。
5.MIC值的判定方法：肉眼下液体培养基清亮与药物空白对照相同为抑菌即阴性，液体培养基混浊或有菌膜生长，则为无抑菌作用即阳性。
6.常规法测MFC值：取50μl有抑菌作用的菌悬液接种于固体沙氏培养基上。25℃孵育5天观察，有菌落生长为阳性，无菌落生长为阴性即杀菌。
7.中性红染色法：取10ul上述菌悬液置于载玻片上，与0.01%中性红10μl充分混匀后，显微镜检查，茵丝和孢子内出现橘红颗粒染料为活性真菌。无染色颗粒的真菌即为死菌。
结果
22株皮肤癣菌体外MIC值测定：特比萘芬MIC值范围0.001-0.008μg/ml，其中红色毛癣菌最低为0.001～0.002μg/ml。伊曲康唑MIC值范围0.001-0.016μg/ml，其中红色毛癣菌最低为0.001～0.002μg/ml，与特比萘芬相同（附表）。
22株皮肤癣菌体外MFC值测定：特比萘芬MFC值0.001～0.008μg/ml，其中红色毛癣菌为0.001-002μg /ml，与MIC值相同，具有杀菌作用。伊曲康唑MFC值0.016～0.256μg/ml，其中红色毛癣菌为0.016～0。064μg /ml。中性红染色法和常规培养法测的MFC值一致（附表）。
讨论
特比萘芬是丙烯胺类广谱抗真菌药，它能抑制真菌细胞的角鲨烯环氧化酶，使麦角固醇合成受阻，以及角鲨烯聚集，从而影响真菌细胞膜功能，起到抗菌作用。通过特比萘芬对22株皮肤癣菌体外抗菌试验结果示MIC值与MFC值相同为0.001～0.008μg/ml，说明特比萘芬有抑菌和杀菌的双重作用。中性红染色法和常规法测定的MFC值相同。
伊曲康唑是三氮唑类衍生物，通过抑制真菌细胞的麦角甾醇的合成而发挥抗菌作用。通过伊曲康唑对22株皮肤癣荫体外抗菌试验MIC值0.001～0.016μg/ml，而MFC值0.016-0.256μg/ml，二者差别不大，证明伊曲康唑对皮肤癣菌也有抑菌和杀菌的效应，中性红染色法与常规法测定的MFC值大致相同。
中性红分子量是288，为水溶性染料，能通过有活性的细胞膜贮存在溶酶体内，染色阳性；当细胞膜和溶酶体膜破坏后，不能摄取染料，因此无活性细胞染色阴性。将中性红染色法应用于真菌研究，已有文献报道【1.2】。我们应用中性红染色法体外测定特比萘芬、伊曲康唑对22株皮肤癣菌抗菌效力，结果表明：应用中性红染色法评价真菌活性和抗真菌药效试验方便、快捷，尤在测定抗真菌药物对真菌的MFc值方面较常规方法优越。由于例数太少，结果只能参考.今后要扩大菌量、菌种，以得出确切的结论。 l
参考文献
1. Naka W，Hanyaku H，Tajima S，et al.Application of neutral red staining for evaluation of theviability of dermatophytes and candida in human skin scales.J Med Vet Mycol，1994，32：34-36.