论文部分内容阅读
摘要:目的：探讨观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)在皮肤缺损创面愈合中的作用，探讨其作为种子细胞修复与重建皮肤的可能性。方法：抽新西兰兔取骨髓，分离、纯化和培养骨髓间充质干细胞;采于兔背部两侧制造全层皮肤缺损创面，将自体BMSCs植于左侧创面，右侧创面以I型胶原为对照。分别于术后3、4、5w将创面大小描印于无菌透明薄膜上，按公式计算创口收缩率，记录治疗组和对照组愈合时间。随机于第4、5周选择实验动物，取创面皮肤，分别行常规组织学检查(HE染色)和BrUd免疫组织化学染色检查。结果：术后两组创面均较干燥，面积逐日缩小，无明显感染征象；在第4周和第5周两组再生皮肤病理切片中，治疗组再生皮肤附件明显丰富，表皮细胞数目显著增多，细胞层次增多，表皮层明显增厚；在第4周和第5周治疗组再生皮肤组织切片中均可见染色阳性细胞，结论：成功利用骨髓间充质干细胞加载体覆盖创面。
关键词:骨髓间充质干细胞；修复；IIIº烧伤
烧伤创面修复需进行大量的自体皮肤移植，自体皮源的不足使得组织工程化皮肤的构建和移植有着诱人的应用前景，倍受关注[1]。但至今还没有任何一种组
织工程皮肤能作为理想的皮肤覆盖物，其中原因之一是未找到合适的种子细胞[2]。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenehymal stem cells，BMSCs)是目前组织工程学研究的一个新兴热点，是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞，具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可分化为多种组织细胞，如成肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、肺细胞、神经细胞等，易于获取，是组织工程较为理想的种子细胞[3]。本实验以兔自体BMCSS体外分离培养、扩增，5-嗅脱氧尿喀咤(5-bormodexoy-uridine，BrdU)标记技术进行细胞标记后，以胶原凝胶为支架材料将其植入IIIº烧伤创面，观察其在皮肤缺损创面愈合中的作用。
1. 研究方法
1. 1骨做间充质干细胞的分离、纯化和培养
取成年家兔30只，用0. 3%的戊巴比妥钠按每公斤体重3mg经耳缘静脉注射麻醉。常规消毒、铺单。取20mL注射器，预先用含肝素钠100U/mL湿润管壁，经胫骨近端内侧进针，缓慢抽取骨髓3-5mL，混入D-Hank＇S液中反复抽吸、吹打，离心(1500r/minx×15min)，弃上清液和脂肪层。沉定用D-Hank＇S液重新打匀，用灭菌的0.17mmol/L HN4CI溶液按1:5的体积比加入己重新打匀的悬液中，4℃下保留10min，取出再离心(1500r/min×15min)，弃上清液，以D-Hank＇S液重新打匀，离心(1000r/min×15min)，弃上清液，取下层有核细胞，加入含10%的胎牛血清、100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素的MDME(低糖)培养基接种于25mc，培养瓶，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，3d后半量换液，倒置显微镜观察。以后2～3d全量换液1次，除去未贴壁细胞，待细胞融合近80%时，用0.25%胰蛋白酶及二乙胺酸四乙酸二钠(ETDA)消化5min，即获得原代贴壁细胞悬液。再以1:3的比例传代培养，为第一代，常规2～3d全量换液1次，留取第三代备用。
1. 2细胞标记
细胞移植前48h，以含5µmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)的培养液孵育。临用前加入质量浓度为0.25%胰蛋白酶及EDAT消化，离心收集细胞，调整细胞数为1×l07/mL备用。
1.3 I型胶原(鼠尾胶原)的制备
取体重250g左右大白鼠2只，从尾根部切断鼠尾，置于质量分数为75%的酒精中浸泡30min无菌条件下将鼠尾切成1.5cm的小段，剔除皮毛，抽出大白鼠尾腿置于平皿中剪碎，按2.5mg/mL的质量分数溶于0.05mmol/L乙酸中，4℃保存48h移入灭菌离心管中离心(4000r/min)30min，取上清液，按每100mL上清液加5g结晶NaCI的比例加入NCaI晶体，可见大量沉淀析出，再次离心(1000/rmin)10min，弃上清液，所得沉淀即I型胶原。将此沉淀重新溶于0.05mmolL/的乙酸中，4℃冰箱保存备用。
1.4I 动物模型制备及BMSCs回植
于兔背部中线两侧，各制造直径为3cm的圆形全厚皮肤缺损创面，立即以I型胶原为载体，将BrdU标记的自体BMCSS单次涂布到左侧创面(治疗组)，右侧创面仅涂布I型胶原(对照组)，内敷凡士林油纱布，采用打包法进行缝合固定后单笼饲养。
1.5创面观察 接种后，密切观察创面情况，于术后3、4、5w将创面大小描印于无菌透明薄膜上，按公式计算创口收缩率，记录治疗组和对照组愈合时间。创口缩率(%)=（闭合创面面积/原创面面积）×100%。
1.6组织学检查 随机于第4、5周选择实验动物，创面中央直径0.5cm范围切取皮肤，分别行常规组织切片检查(HE染色)和免疫组织化学染色检查。石蜡切片常规脱蜡至水，用苏木精一伊红染色法(HE染色)染色，光镜下观察。
1.7免疫组织化学染色检查 连续切片，采用SACB免疫组化检测。严格按博士德公司试剂盒说明书操作，二氨基联苯胺(DAB)显色。鼠抗BrdU单克隆抗体(美国Simga公司)工作浓度1:1000，二抗羊抗鼠抗体工作浓度1:100。于显微镜下观察染色结果，细胞核呈棕黄色为BdrU阳性细胞。
1.8统计方法 实验结果以x士s表示，组间差异采用t检验，使用SPSS10.0统计分析软件分析，p<0.05认为有统计学意义。
2.结果
2.1创面观察 术后两组创面均较干燥，面积逐日缩小，无明显感染征象，术后d6治疗组创面收缩27.9%士7.9%，对照组23.0%士7.2%( <0.05);术后1d，2治疗组创面收缩率89.1%士10.4%，对照组80.7%土12.2%，两组间差异有显著性意义(p<0.05)。创面愈合时间，治疗组为(14.0士1.2)d，对照组为(16.5士1.0)d，两组间差异有显著性(P<0.05)。
2.2常规组织学观察 在第4周和第5周两组再生皮肤病理切片中，治疗组再生皮肤附件明显丰富，表皮细胞数目显著增多，细胞层次增多，表皮层明显增厚。
2.3免疫组织化学染色结果 在第4周和第5周治疗组再生皮肤组织切片中均可见5-BrUd染色阳性细胞，阳性细胞多位于皮肤附件毛囊内层上皮根鞘以及再生表皮的基底层、棘层，在形态学上此类细胞呈立方形或多边形，与周围表皮细胞无明显差异，且可见其相邻生长。
3.讨论
BMSCs是1966年首次提出的能自我复制并分化为数种间充质组织的骨髓细胞，被认为是除造血干细胞外，另一种中胚层来源的未分化细胞[4]。目前常用的分离BMSC。的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，本实验所采用的全骨髓法先通过离心去除抗凝骨髓血的血浆而保留其细胞成分，再经NH4CL处理破坏红细胞，再根据干细胞在低血清培养基中培养有帖壁生长优势的特性，定期换液除去不帖壁细胞，从而达到纯化及扩增BMSCs的目的。关于BMSCs细胞的鉴定，目前认为BMSC。的抗原表型具有多种细胞的特征(如CD44)，但不表达造血干细胞的标志(CD45)，在细胞筛选时可作为一定的参考依据[5]。
BMSCs不仅可分化为多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞;MBSCs也能分化为中胚层来源以外的组织细胞，如神经细胞、心肌细胞等[6]。Termani等[7]对MBscs的基因表达进行分析，发现它不仅含有编码间质组织成分的基因，还含有编码内皮及上皮组织的基因。
本研究以新西兰兔为研究对象，提取抽取骨髓，采用直接贴壁法分离、纯化和培养骨髓间充质干细胞;采于兔背部两侧制造全层皮肤缺损创面，以I型胶原为载体，将己用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记的自体BMSCs植于左侧创面，右侧创面以I型胶原为对照。分别于术后3、4、5w将创面大小描印于无菌透明薄膜上，按公式计算创口收缩率，记录治疗组和对照组愈合时间。随机于第4、5周选择实验动物，取创面中央直径0.5cm范围的皮肤，分别行常规组织学检查(HE染色)和BrUd免疫组织化学染色检查。观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)在皮肤缺损创面愈合中的作用，探讨其作为种子细胞修复与重建皮肤的可能性。
参考文献：
「1」Zhu X, Du J, Liu G. The comparison of multilineage differentiation of bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells. Clin Lab. 2012;58(9-10):897-903.
「2」Yi D, Wu C, Ma X, Ji H, Zheng X, Chang J. Preparation and in vitro evaluation of plasma-sprayed bioactive akermanite coatings. Biomed Mater. 2012;7(6):065004.
「3」Huang Y, Chang C, Zhang JW, Gao XQ. [Alternation of proteins in brain of Parkinson's disease model rats after the transplantation of TH-NTN gene modified bone marrow mesenchymal stem cells]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2012 Sep 4;92(33):2353-2356.
「4」Liu DD, Zhang JC, Zhang Q, Wang SX, Yang MS. TGF-β/BMP signaling pathway is involved in cerium-promoted osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 2012. doi: 10.1002/jcb.24451.
资助项目：湖南省卫生厅课题资助（项目编号: B2007-106）
关键词:骨髓间充质干细胞；修复；IIIº烧伤
烧伤创面修复需进行大量的自体皮肤移植，自体皮源的不足使得组织工程化皮肤的构建和移植有着诱人的应用前景，倍受关注[1]。但至今还没有任何一种组
织工程皮肤能作为理想的皮肤覆盖物，其中原因之一是未找到合适的种子细胞[2]。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenehymal stem cells，BMSCs)是目前组织工程学研究的一个新兴热点，是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞，具有多向分化潜能，在不同的诱导条件下可分化为多种组织细胞，如成肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、肺细胞、神经细胞等，易于获取，是组织工程较为理想的种子细胞[3]。本实验以兔自体BMCSS体外分离培养、扩增，5-嗅脱氧尿喀咤(5-bormodexoy-uridine，BrdU)标记技术进行细胞标记后，以胶原凝胶为支架材料将其植入IIIº烧伤创面，观察其在皮肤缺损创面愈合中的作用。
1. 研究方法
1. 1骨做间充质干细胞的分离、纯化和培养
取成年家兔30只，用0. 3%的戊巴比妥钠按每公斤体重3mg经耳缘静脉注射麻醉。常规消毒、铺单。取20mL注射器，预先用含肝素钠100U/mL湿润管壁，经胫骨近端内侧进针，缓慢抽取骨髓3-5mL，混入D-Hank＇S液中反复抽吸、吹打，离心(1500r/minx×15min)，弃上清液和脂肪层。沉定用D-Hank＇S液重新打匀，用灭菌的0.17mmol/L HN4CI溶液按1:5的体积比加入己重新打匀的悬液中，4℃下保留10min，取出再离心(1500r/min×15min)，弃上清液，以D-Hank＇S液重新打匀，离心(1000r/min×15min)，弃上清液，取下层有核细胞，加入含10%的胎牛血清、100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素的MDME(低糖)培养基接种于25mc，培养瓶，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，3d后半量换液，倒置显微镜观察。以后2～3d全量换液1次，除去未贴壁细胞，待细胞融合近80%时，用0.25%胰蛋白酶及二乙胺酸四乙酸二钠(ETDA)消化5min，即获得原代贴壁细胞悬液。再以1:3的比例传代培养，为第一代，常规2～3d全量换液1次，留取第三代备用。
1. 2细胞标记
细胞移植前48h，以含5µmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)的培养液孵育。临用前加入质量浓度为0.25%胰蛋白酶及EDAT消化，离心收集细胞，调整细胞数为1×l07/mL备用。
1.3 I型胶原(鼠尾胶原)的制备
取体重250g左右大白鼠2只，从尾根部切断鼠尾，置于质量分数为75%的酒精中浸泡30min无菌条件下将鼠尾切成1.5cm的小段，剔除皮毛，抽出大白鼠尾腿置于平皿中剪碎，按2.5mg/mL的质量分数溶于0.05mmol/L乙酸中，4℃保存48h移入灭菌离心管中离心(4000r/min)30min，取上清液，按每100mL上清液加5g结晶NaCI的比例加入NCaI晶体，可见大量沉淀析出，再次离心(1000/rmin)10min，弃上清液，所得沉淀即I型胶原。将此沉淀重新溶于0.05mmolL/的乙酸中，4℃冰箱保存备用。
1.4I 动物模型制备及BMSCs回植
于兔背部中线两侧，各制造直径为3cm的圆形全厚皮肤缺损创面，立即以I型胶原为载体，将BrdU标记的自体BMCSS单次涂布到左侧创面(治疗组)，右侧创面仅涂布I型胶原(对照组)，内敷凡士林油纱布，采用打包法进行缝合固定后单笼饲养。
1.5创面观察 接种后，密切观察创面情况，于术后3、4、5w将创面大小描印于无菌透明薄膜上，按公式计算创口收缩率，记录治疗组和对照组愈合时间。创口缩率(%)=（闭合创面面积/原创面面积）×100%。
1.6组织学检查 随机于第4、5周选择实验动物，创面中央直径0.5cm范围切取皮肤，分别行常规组织切片检查(HE染色)和免疫组织化学染色检查。石蜡切片常规脱蜡至水，用苏木精一伊红染色法(HE染色)染色，光镜下观察。
1.7免疫组织化学染色检查 连续切片，采用SACB免疫组化检测。严格按博士德公司试剂盒说明书操作，二氨基联苯胺(DAB)显色。鼠抗BrdU单克隆抗体(美国Simga公司)工作浓度1:1000，二抗羊抗鼠抗体工作浓度1:100。于显微镜下观察染色结果，细胞核呈棕黄色为BdrU阳性细胞。
1.8统计方法 实验结果以x士s表示，组间差异采用t检验，使用SPSS10.0统计分析软件分析，p<0.05认为有统计学意义。
2.结果
2.1创面观察 术后两组创面均较干燥，面积逐日缩小，无明显感染征象，术后d6治疗组创面收缩27.9%士7.9%，对照组23.0%士7.2%( <0.05);术后1d，2治疗组创面收缩率89.1%士10.4%，对照组80.7%土12.2%，两组间差异有显著性意义(p<0.05)。创面愈合时间，治疗组为(14.0士1.2)d，对照组为(16.5士1.0)d，两组间差异有显著性(P<0.05)。
2.2常规组织学观察 在第4周和第5周两组再生皮肤病理切片中，治疗组再生皮肤附件明显丰富，表皮细胞数目显著增多，细胞层次增多，表皮层明显增厚。
2.3免疫组织化学染色结果 在第4周和第5周治疗组再生皮肤组织切片中均可见5-BrUd染色阳性细胞，阳性细胞多位于皮肤附件毛囊内层上皮根鞘以及再生表皮的基底层、棘层，在形态学上此类细胞呈立方形或多边形，与周围表皮细胞无明显差异，且可见其相邻生长。
3.讨论
BMSCs是1966年首次提出的能自我复制并分化为数种间充质组织的骨髓细胞，被认为是除造血干细胞外，另一种中胚层来源的未分化细胞[4]。目前常用的分离BMSC。的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，本实验所采用的全骨髓法先通过离心去除抗凝骨髓血的血浆而保留其细胞成分，再经NH4CL处理破坏红细胞，再根据干细胞在低血清培养基中培养有帖壁生长优势的特性，定期换液除去不帖壁细胞，从而达到纯化及扩增BMSCs的目的。关于BMSCs细胞的鉴定，目前认为BMSC。的抗原表型具有多种细胞的特征(如CD44)，但不表达造血干细胞的标志(CD45)，在细胞筛选时可作为一定的参考依据[5]。
BMSCs不仅可分化为多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞;MBSCs也能分化为中胚层来源以外的组织细胞，如神经细胞、心肌细胞等[6]。Termani等[7]对MBscs的基因表达进行分析，发现它不仅含有编码间质组织成分的基因，还含有编码内皮及上皮组织的基因。
本研究以新西兰兔为研究对象，提取抽取骨髓，采用直接贴壁法分离、纯化和培养骨髓间充质干细胞;采于兔背部两侧制造全层皮肤缺损创面，以I型胶原为载体，将己用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记的自体BMSCs植于左侧创面，右侧创面以I型胶原为对照。分别于术后3、4、5w将创面大小描印于无菌透明薄膜上，按公式计算创口收缩率，记录治疗组和对照组愈合时间。随机于第4、5周选择实验动物，取创面中央直径0.5cm范围的皮肤，分别行常规组织学检查(HE染色)和BrUd免疫组织化学染色检查。观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)在皮肤缺损创面愈合中的作用，探讨其作为种子细胞修复与重建皮肤的可能性。
参考文献：
「1」Zhu X, Du J, Liu G. The comparison of multilineage differentiation of bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells. Clin Lab. 2012;58(9-10):897-903.
「2」Yi D, Wu C, Ma X, Ji H, Zheng X, Chang J. Preparation and in vitro evaluation of plasma-sprayed bioactive akermanite coatings. Biomed Mater. 2012;7(6):065004.
「3」Huang Y, Chang C, Zhang JW, Gao XQ. [Alternation of proteins in brain of Parkinson's disease model rats after the transplantation of TH-NTN gene modified bone marrow mesenchymal stem cells]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2012 Sep 4;92(33):2353-2356.
「4」Liu DD, Zhang JC, Zhang Q, Wang SX, Yang MS. TGF-β/BMP signaling pathway is involved in cerium-promoted osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 2012. doi: 10.1002/jcb.24451.
资助项目：湖南省卫生厅课题资助（项目编号: B2007-106）