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摘要：目的 观察脾气虚大鼠血清、小肠神经肽Y（NPY）和血管活性肠肽（VIP）含量，小肠组织丝裂原活化蛋白激酶14（Mapk14）mRNA表达的变化及益气健脾中药的干预效应，以揭示脾气虚证发生的内在机制。方法 受试动物随机分为空白组、模型组（7、14、21 d组）、益气健脾组，每组10只。除空白组外，其余各组采用大黄法、力竭法及饥饿法复合法建立脾气虚证大鼠模型，造模同时益气健脾组每日给予四君子汤20 g/kg干预21 d，各组大鼠分时段采用放免法测定小肠、血清NPY和VIP含量，采用实时荧光定量PCR检测小肠组织Mapk14 mRNA表达水平。结果 与空白组比较，模型组大鼠血清及小肠组织NPY含量降低（P<0.05），VIP含量升高（P<0.05），小肠组织Mapk14 mRNA相对表达量升高（P<0.05），且以模型21 d组显著；与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠血清及小肠组织NPY含量升高（P<0.05），VIP含量降低（P<0.05），小肠组织Mapk14 mRNA相对表达量降低（P<0.05）。结论 益气健脾中药具有调节脑肠肽NPY、VIP分泌及抑制小肠组织Mapk14 mRNA异常表达的作用。
关键词：脾气虚证；神经肽Y；血管活性肠肽；丝裂原活化蛋白激酶；四君子汤；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0059-04
中医临床“脾虚证”病程中出现纳呆、腹胀、大便溏结不调等症状均为胃肠道生理功能紊乱所致。研究表明，胃肠激素分泌紊乱是导致胃肠功能障碍和脾虚发生的原因之一[1]。而丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，Mapk）级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质，它与细胞凋亡、增殖、肿瘤发生以及氧化应激性肠上皮细胞损伤等有密切关系，是细胞内信号传递的重要途径[2-4]。本课题以脾气虚证大鼠为对象，研究神经肽Y（NPY）、血管活性肠肽（VIP）和Mapk14基因在脾气虚证病程中的变化及益气健脾中药的干预效应，以揭示脾气虚证发生的内在机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，3月龄，雌雄各半，体质量（180±20）g，甘肃中医学院医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314。
1.2 药物与试剂
中药均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司。益气健脾中药（四君子汤）以人参、白术、茯苓、甘草按3∶3∶3∶2比例配制，第1次加10倍量蒸馏水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度。大黄制剂：将生大黄饮片粉碎，用蒸馏水浸泡，置于50 ℃水浴6 h，去渣，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，4 ℃保存备用。NPY放免试剂盒（批号20110927）、VIP放免试剂盒（批号20111014）均购自北京华英生物技术研究所；Trizol 试剂（批号AK7208-1）、反转录及Real Time qPCR试剂盒（批号0000036802）均购自Promega Corporation。
1.3 主要仪器
DF110型电子分析天平，XYJ80-2离心机，HH-4数显恒温水浴箱，FT-630G微机多探头γ计数器， KDC-2044低速冷冻离心机，BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪，S1000TM逆转录仪，Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统，CFX96TM Optics Module PCR仪（美国BIO-RAD公司）。
2 实验方法
2.1 分组与造模
适应性饲养1周后，受试动物按体质量编号，采用随机数字表法[5]分为空白组、模型组（7、14、21 d组）、益气健脾组，每组10只，雌雄各半分笼饲养。除空白组外，其余各组参考文献[6]，以大黄法、力竭法及饥饿法三因素复合法复制脾气虚证模型。每日上午以1 mL/100 g体质量灌服大黄制剂液；每日下午将动物负重，于大鼠尾根部缠绕质量为该大鼠体质量10%的保险丝，放入水深50 cm、水温20 ℃的水槽中游泳，以力竭（即大鼠鼻尖没入水面10 s）为度。控制饮食，每日8：00给食，20：00撤食，共21 d。
2.2 给药
造模同时，益气健脾组每日给予四君子汤20 g/kg灌胃，灌胃容积为1 mL/100 g体质量，连续给药3周；空白组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃。
2.3 标本采集与检测
造模时分别于第7、14、21日取材并制备待检样本。各组大鼠于末次灌胃给药后，禁食不禁水24 h，乌拉坦（1 g/kg）麻醉采血后断头处死并制备待检标本。血清制备：股动脉取血4 mL，静置2 h后2000 r/min离心10 min，取上清，放入尖底管中，4 ℃低温冰箱保存备用。采用放免法，按试剂盒说明检测NPY和VIP。小肠组织的收集：动物处死后，迅速截取近胃窦端小肠组织，其中一部分小肠组织置于用DEPC处理过的冻存管中，于-80 ℃冷冻保存待测Mapk14基因表达；一部分小肠组织称重后，用眼科小剪刀尽快剪碎，分别置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中），3500 r/min离心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，小肠组织匀浆上清液采用放免法待检NPY和VIP。
2.4 小肠丝裂原活化蛋白激酶14基因表达水平检测
采用实时荧光定量PCR法。取适量小肠组织，用Trizol法抽提总RNA：称取50 mg小肠组织块置于研钵中，加入1 mL Trizol研磨均匀，冰上孵育5 min， 4 ℃、12 000 g离心5 min；移入离心管中，冰上孵育5 min，加0.2 mL氯仿，震荡后4 ℃、12 000 g离心15 min，取上清液移至新离心管，加0.5 mL异丙醇，震荡，冰上孵育10 min，4 ℃、12 000 g离心 10 min，弃上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震荡后4 ℃、8000 g离心10 min，弃上清液，室温下干燥，加入50 μL DEPC处理水溶解RNA。核酸定量分析仪测定其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测，提取的RNA符合纯度要求，可用于后续PCR。 反转录合成模板cDNA：在0.5 mL去酶管中加入总RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μL、Random Primer 1 μL，加Nuclease-Free Water至10 μL；70 ℃变性5 min，冰上放置5 min以上；加入逆转录GoScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，PCR Nucleotide Mix（10 mmol/L）1 μL，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water至10 μL，总体积为20 μL。混匀配制的反应混合物，短暂离心后25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再70 ℃ 15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。
引物设计：从NCBI中查询目标基因ID及序列，由TAKARA公司[宝生物工程（大连）有限公司]设计和合成目标基因引物。见表1。
实时荧光定量PCR以β-actin作为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、8次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循环40 次，终末延伸65 ℃、5 s，95 ℃。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值。用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），相对表达量=2-ΔΔCt。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据用—x±s表示，组间样本均数差异比较用F检验，F检验差异有统计学意义时，再用q检验进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及饮食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。模型组大鼠多数在第5日即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯；第10日后出现少食、怠动、消瘦，肛周污秽，部分动物出现脱肛，动作迟缓，甚至行动歪斜，同时毛发失去正常光泽而枯槁、疏散，而后出现畏寒，成群蜷缩或拱背，并逐渐出现体质量减轻，大便增多（垫料呈橘黄色）等脾虚症状。益气健脾组大鼠第6日出现轻度倦卧、被毛稀疏干枯；第13日后出现少食、怠动、消瘦，肛周污秽，少部分动物出现脱肛，动作迟缓，大便增多等；第16日后上述症状开始减轻或消失，表现为反应较为灵敏，活动及饮食量正常，被毛疏散但有光泽，粪便部分呈颗粒状。
4.2 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清和小肠神经肽Y含量的影响
与空白组比较，模型7、14、21 d组大鼠血清和小肠NPY含量均降低，其中以模型14、21 d降低明显 （P<0.05，P<0.01），且模型组7 d与21 d之间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠血清和小肠NPY计数水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
4.3 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血管活性肠肽含量的影响
与空白组比较，模型7、14、21 d组大鼠血清和小肠VIP含量升高，其中模型21 d组升高明显（P<0.05，P<0.01）；与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠小肠VIP含量降低，差异有统计学意义（P<0.05），血清VIP含量虽有降低趋势，但与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
4.4 丝裂原活化蛋白激酶14实验样品扩增曲线与融解曲线
通过融解曲线得知，扩增具有特异性。见图1、图2。
4.5 益气健脾中药对脾气虚证大鼠小肠丝裂原活化蛋白激酶14 mRNA的影响
与空白组比较，模型7、14、21 d组大鼠小肠Mapk14 mRNA相对表达量升高，以模型21 d组最为显著（P<0.05），各模型组间差异无统计学意义；与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠小肠Mapk14 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
5 讨论
中医脏腑疾病的证候基础和治则治法研究是临床辨证论治的前提和基础，其中脾虚证在诸多疾病中广泛存在，故而研究脾虚证发生机制及益气健脾法的干预效应具有重要指导价值。脾虚证是以消化系统为主的多系统、多器官的功能紊乱，是一种全身性的病理状态，但均存在胃肠道运动功能紊乱，消化吸收功能下降，淀粉酶活性下降及其化学消化能力低下，胃排空加速，小肠吸收功能下降。同时胃肠道内分泌及激素异常，餐后血清胃泌素明显降低，G细胞合成分泌功能减弱[6-7]，提示脾虚证的发生机制复杂。中医临床和实验研究表明，益气健脾中药（如四君子汤类方）能够显著改善脾虚诸症，其中四君子汤以脾虚胃弱为主治证候，是体现益气健脾法的代表方剂，由人参、白术、茯苓和炙甘草组成。方中人参性甘大补脾胃之气；白术苦温，助君药人参燥湿健脾；茯苓甘淡健脾，渗湿利水；炙甘草味甘性微温，和中益气。四药相合，具有益气健脾之功效，亦能体现通过益气健脾以助脾之“运化”的功效[8-11]。
NPY是由36个氨基酸残基组成的多肽，广泛分布于哺乳动物中枢神经系统和肠道交感神经丛，肠神经丛中NPY可与肠黏膜下神经节中的周围性胆碱乙酰转移酶相结合，从而发挥刺激食欲、增强营养物质吸收的作用，其在胃肠道的作用是抑制性的，为肠道体液和电解质分泌的强抑制剂，能够抑制肠液和胰液的分泌，抑制胃肠运动[12]。VIP是由28个氨基酸组成的肽类物质，既是胃肠道激素又是神经肽，作为抑制性神经递质，VIP可减慢胃排空，抑制胃酸及胃蛋白酶，抑制小肠环形括约肌收缩，降低十二指肠收缩频率，松弛结肠平滑肌，减弱结肠运动[13]。NPY/VIP在消化系统疾病及胃肠生理功能紊乱中起重要作用，基于“脾主运化”理论推测，可能是脾虚证发生的物质基础之一。 MAPK信号途径存在于所有生物体内的大多数细胞内，是真核生物细胞重要的信号转导通路，可将细胞表面信号刺激转导至细胞及其核内，与细胞增殖、存活、分化、凋亡等生理过程密切相关[13]，其中Mapk14属于“应激诱导”的MAPK，激活的Mapk14能通过激活内源性通路，使下游c-myc表达增强，诱导bax转位，亦可增强肿瘤坏死因子-α表达，诱导细胞生理功能紊乱和细胞凋亡[14]。
本研究结果显示：与空白组比较，模型各组大鼠血清、小肠NPY含量降低，且以模型14 d、21 d组显著（P<0.05），模型各组大鼠血清、小肠VIP含量和小肠Mapk14 mRNA相对表达量有升高趋势，以模型21 d组显著（P<0.05），说明脾虚病程中存在NPY分泌不足，其对胃肠抑制性作用降低而导致胃肠蠕动紊乱，而抑制性脑肠肽VIP含量异常增高可能与机体胃肠应激性反应并促进VIP高分泌有关。有研究表明，异常增加的VIP可引起肠道黏膜血管扩张（导致黏膜充血或水肿）和平滑肌松弛，引起水分吸收减少、肠液分泌增加而诱发腹泻，同时小肠Mapk14 mRNA相对表达量升高说明MAPK信号途径中Mapk14因“应激诱导”而异常高表达，此效应可能会导致小肠黏膜细胞功能紊乱[15]。经益气健脾中药（四君子汤）干预治疗后，与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠血清、小肠NPY水平升高（P<0.05），小肠VIP含量和小肠Mapk14 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05），血清VIP含量虽有降低趋势，但与模型各组比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究结果初步表明脾气虚病程中不但存在胃肠激素分泌紊乱，且可能与MAPK信号通路中Mapk14“应激诱导”和异常表达有关，且提示益气健脾中药（四君子汤）具有调节NPY、VIP正常分泌和抑制Mapk14异常表达的作用。
参考文献：
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[15] Timothy R. Idiopathic distribution of regulatory peptides in the sigmold-recto-anal region of the human gut[J]. Gut，1988，29：300.
（收稿日期：2013-09-20，编辑：华强）
关键词：脾气虚证；神经肽Y；血管活性肠肽；丝裂原活化蛋白激酶；四君子汤；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）04-0059-04
中医临床“脾虚证”病程中出现纳呆、腹胀、大便溏结不调等症状均为胃肠道生理功能紊乱所致。研究表明，胃肠激素分泌紊乱是导致胃肠功能障碍和脾虚发生的原因之一[1]。而丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，Mapk）级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质，它与细胞凋亡、增殖、肿瘤发生以及氧化应激性肠上皮细胞损伤等有密切关系，是细胞内信号传递的重要途径[2-4]。本课题以脾气虚证大鼠为对象，研究神经肽Y（NPY）、血管活性肠肽（VIP）和Mapk14基因在脾气虚证病程中的变化及益气健脾中药的干预效应，以揭示脾气虚证发生的内在机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，3月龄，雌雄各半，体质量（180±20）g，甘肃中医学院医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK（甘）2011-0001-0000314。
1.2 药物与试剂
中药均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司。益气健脾中药（四君子汤）以人参、白术、茯苓、甘草按3∶3∶3∶2比例配制，第1次加10倍量蒸馏水浸泡4 h。按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度。大黄制剂：将生大黄饮片粉碎，用蒸馏水浸泡，置于50 ℃水浴6 h，去渣，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，4 ℃保存备用。NPY放免试剂盒（批号20110927）、VIP放免试剂盒（批号20111014）均购自北京华英生物技术研究所；Trizol 试剂（批号AK7208-1）、反转录及Real Time qPCR试剂盒（批号0000036802）均购自Promega Corporation。
1.3 主要仪器
DF110型电子分析天平，XYJ80-2离心机，HH-4数显恒温水浴箱，FT-630G微机多探头γ计数器， KDC-2044低速冷冻离心机，BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪，S1000TM逆转录仪，Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统，CFX96TM Optics Module PCR仪（美国BIO-RAD公司）。
2 实验方法
2.1 分组与造模
适应性饲养1周后，受试动物按体质量编号，采用随机数字表法[5]分为空白组、模型组（7、14、21 d组）、益气健脾组，每组10只，雌雄各半分笼饲养。除空白组外，其余各组参考文献[6]，以大黄法、力竭法及饥饿法三因素复合法复制脾气虚证模型。每日上午以1 mL/100 g体质量灌服大黄制剂液；每日下午将动物负重，于大鼠尾根部缠绕质量为该大鼠体质量10%的保险丝，放入水深50 cm、水温20 ℃的水槽中游泳，以力竭（即大鼠鼻尖没入水面10 s）为度。控制饮食，每日8：00给食，20：00撤食，共21 d。
2.2 给药
造模同时，益气健脾组每日给予四君子汤20 g/kg灌胃，灌胃容积为1 mL/100 g体质量，连续给药3周；空白组、模型组给予同体积蒸馏水灌胃。
2.3 标本采集与检测
造模时分别于第7、14、21日取材并制备待检样本。各组大鼠于末次灌胃给药后，禁食不禁水24 h，乌拉坦（1 g/kg）麻醉采血后断头处死并制备待检标本。血清制备：股动脉取血4 mL，静置2 h后2000 r/min离心10 min，取上清，放入尖底管中，4 ℃低温冰箱保存备用。采用放免法，按试剂盒说明检测NPY和VIP。小肠组织的收集：动物处死后，迅速截取近胃窦端小肠组织，其中一部分小肠组织置于用DEPC处理过的冻存管中，于-80 ℃冷冻保存待测Mapk14基因表达；一部分小肠组织称重后，用眼科小剪刀尽快剪碎，分别置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中），3500 r/min离心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，小肠组织匀浆上清液采用放免法待检NPY和VIP。
2.4 小肠丝裂原活化蛋白激酶14基因表达水平检测
采用实时荧光定量PCR法。取适量小肠组织，用Trizol法抽提总RNA：称取50 mg小肠组织块置于研钵中，加入1 mL Trizol研磨均匀，冰上孵育5 min， 4 ℃、12 000 g离心5 min；移入离心管中，冰上孵育5 min，加0.2 mL氯仿，震荡后4 ℃、12 000 g离心15 min，取上清液移至新离心管，加0.5 mL异丙醇，震荡，冰上孵育10 min，4 ℃、12 000 g离心 10 min，弃上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震荡后4 ℃、8000 g离心10 min，弃上清液，室温下干燥，加入50 μL DEPC处理水溶解RNA。核酸定量分析仪测定其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测，提取的RNA符合纯度要求，可用于后续PCR。 反转录合成模板cDNA：在0.5 mL去酶管中加入总RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μL、Random Primer 1 μL，加Nuclease-Free Water至10 μL；70 ℃变性5 min，冰上放置5 min以上；加入逆转录GoScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，PCR Nucleotide Mix（10 mmol/L）1 μL，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water至10 μL，总体积为20 μL。混匀配制的反应混合物，短暂离心后25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再70 ℃ 15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。
引物设计：从NCBI中查询目标基因ID及序列，由TAKARA公司[宝生物工程（大连）有限公司]设计和合成目标基因引物。见表1。
实时荧光定量PCR以β-actin作为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、8次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循环40 次，终末延伸65 ℃、5 s，95 ℃。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值。用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），相对表达量=2-ΔΔCt。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析，实验数据用—x±s表示，组间样本均数差异比较用F检验，F检验差异有统计学意义时，再用q检验进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及饮食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。模型组大鼠多数在第5日即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯；第10日后出现少食、怠动、消瘦，肛周污秽，部分动物出现脱肛，动作迟缓，甚至行动歪斜，同时毛发失去正常光泽而枯槁、疏散，而后出现畏寒，成群蜷缩或拱背，并逐渐出现体质量减轻，大便增多（垫料呈橘黄色）等脾虚症状。益气健脾组大鼠第6日出现轻度倦卧、被毛稀疏干枯；第13日后出现少食、怠动、消瘦，肛周污秽，少部分动物出现脱肛，动作迟缓，大便增多等；第16日后上述症状开始减轻或消失，表现为反应较为灵敏，活动及饮食量正常，被毛疏散但有光泽，粪便部分呈颗粒状。
4.2 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血清和小肠神经肽Y含量的影响
与空白组比较，模型7、14、21 d组大鼠血清和小肠NPY含量均降低，其中以模型14、21 d降低明显 （P<0.05，P<0.01），且模型组7 d与21 d之间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠血清和小肠NPY计数水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
4.3 益气健脾中药对脾气虚证大鼠血管活性肠肽含量的影响
与空白组比较，模型7、14、21 d组大鼠血清和小肠VIP含量升高，其中模型21 d组升高明显（P<0.05，P<0.01）；与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠小肠VIP含量降低，差异有统计学意义（P<0.05），血清VIP含量虽有降低趋势，但与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
4.4 丝裂原活化蛋白激酶14实验样品扩增曲线与融解曲线
通过融解曲线得知，扩增具有特异性。见图1、图2。
4.5 益气健脾中药对脾气虚证大鼠小肠丝裂原活化蛋白激酶14 mRNA的影响
与空白组比较，模型7、14、21 d组大鼠小肠Mapk14 mRNA相对表达量升高，以模型21 d组最为显著（P<0.05），各模型组间差异无统计学意义；与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠小肠Mapk14 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
5 讨论
中医脏腑疾病的证候基础和治则治法研究是临床辨证论治的前提和基础，其中脾虚证在诸多疾病中广泛存在，故而研究脾虚证发生机制及益气健脾法的干预效应具有重要指导价值。脾虚证是以消化系统为主的多系统、多器官的功能紊乱，是一种全身性的病理状态，但均存在胃肠道运动功能紊乱，消化吸收功能下降，淀粉酶活性下降及其化学消化能力低下，胃排空加速，小肠吸收功能下降。同时胃肠道内分泌及激素异常，餐后血清胃泌素明显降低，G细胞合成分泌功能减弱[6-7]，提示脾虚证的发生机制复杂。中医临床和实验研究表明，益气健脾中药（如四君子汤类方）能够显著改善脾虚诸症，其中四君子汤以脾虚胃弱为主治证候，是体现益气健脾法的代表方剂，由人参、白术、茯苓和炙甘草组成。方中人参性甘大补脾胃之气；白术苦温，助君药人参燥湿健脾；茯苓甘淡健脾，渗湿利水；炙甘草味甘性微温，和中益气。四药相合，具有益气健脾之功效，亦能体现通过益气健脾以助脾之“运化”的功效[8-11]。
NPY是由36个氨基酸残基组成的多肽，广泛分布于哺乳动物中枢神经系统和肠道交感神经丛，肠神经丛中NPY可与肠黏膜下神经节中的周围性胆碱乙酰转移酶相结合，从而发挥刺激食欲、增强营养物质吸收的作用，其在胃肠道的作用是抑制性的，为肠道体液和电解质分泌的强抑制剂，能够抑制肠液和胰液的分泌，抑制胃肠运动[12]。VIP是由28个氨基酸组成的肽类物质，既是胃肠道激素又是神经肽，作为抑制性神经递质，VIP可减慢胃排空，抑制胃酸及胃蛋白酶，抑制小肠环形括约肌收缩，降低十二指肠收缩频率，松弛结肠平滑肌，减弱结肠运动[13]。NPY/VIP在消化系统疾病及胃肠生理功能紊乱中起重要作用，基于“脾主运化”理论推测，可能是脾虚证发生的物质基础之一。 MAPK信号途径存在于所有生物体内的大多数细胞内，是真核生物细胞重要的信号转导通路，可将细胞表面信号刺激转导至细胞及其核内，与细胞增殖、存活、分化、凋亡等生理过程密切相关[13]，其中Mapk14属于“应激诱导”的MAPK，激活的Mapk14能通过激活内源性通路，使下游c-myc表达增强，诱导bax转位，亦可增强肿瘤坏死因子-α表达，诱导细胞生理功能紊乱和细胞凋亡[14]。
本研究结果显示：与空白组比较，模型各组大鼠血清、小肠NPY含量降低，且以模型14 d、21 d组显著（P<0.05），模型各组大鼠血清、小肠VIP含量和小肠Mapk14 mRNA相对表达量有升高趋势，以模型21 d组显著（P<0.05），说明脾虚病程中存在NPY分泌不足，其对胃肠抑制性作用降低而导致胃肠蠕动紊乱，而抑制性脑肠肽VIP含量异常增高可能与机体胃肠应激性反应并促进VIP高分泌有关。有研究表明，异常增加的VIP可引起肠道黏膜血管扩张（导致黏膜充血或水肿）和平滑肌松弛，引起水分吸收减少、肠液分泌增加而诱发腹泻，同时小肠Mapk14 mRNA相对表达量升高说明MAPK信号途径中Mapk14因“应激诱导”而异常高表达，此效应可能会导致小肠黏膜细胞功能紊乱[15]。经益气健脾中药（四君子汤）干预治疗后，与模型21 d组比较，益气健脾组大鼠血清、小肠NPY水平升高（P<0.05），小肠VIP含量和小肠Mapk14 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05），血清VIP含量虽有降低趋势，但与模型各组比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究结果初步表明脾气虚病程中不但存在胃肠激素分泌紊乱，且可能与MAPK信号通路中Mapk14“应激诱导”和异常表达有关，且提示益气健脾中药（四君子汤）具有调节NPY、VIP正常分泌和抑制Mapk14异常表达的作用。
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（收稿日期：2013-09-20，编辑：华强）