论文部分内容阅读
摘要：目的 观察中药活性成分姜酚对类风湿关节炎（RA）模型大鼠血清白细胞介素（IL）-17、IL-23的影响，探讨其作用机制。方法 40只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、姜酚组和雷公藤组。采用胶原诱导制备RA模型，于造模第7日开始，姜酚组给予姜酚灌胃，雷公藤组给予雷公藤多苷灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。治疗4周后采血并处死大鼠，镜下观察大鼠关节滑膜病理，ELISA检测大鼠血清IL-17、IL-23的表达。结果 病理观察结果显示，与模型组比较，姜酚组关节滑膜组织血管新生及滑膜增生减轻，炎细胞浸润、水肿改善。模型组IL-17、IL-23表达明显高于正常组（P<0.01）；与模型组比较，姜酚组和雷公藤组均能下调IL-17、IL-23表达（P<0.05，P<0.01），姜酚组优于雷公藤组（P<0.05）。结论 姜酚通过下调RA大鼠血清IL-17、IL-23的表达起到一定的治疗作用。
关键词：胶原诱导性关节炎；白细胞介素-17；白细胞介素-23；姜酚；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0043-03
Effects of Ginger Phenol on IL-17 and IL-23 in Serum of Rheumatoid Arthritis Model Rats MA Wu-kai， YAO Xue-ming， HUANG Ying， TANG Fang， WANG Ying， ZHOU Jing （The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of TCM， Guiyang 550003， China）
Abstract：Objective To observe the effects of Chinese medicine ingredient ginger phenol on expressions of IL-17 and IL-23 in collagen-induced arthritis （CIA） rats；To investigate the role and mechanism of ginger phenol in CIA rats. Methods Forty female Wistar rats were randomly divided into 4 groups：blank group， model control group， ginger phenol treatment group and tripterygium glucosides control group. After CIA was established in rats successfully， ginger phenol treatment group and tripterygium glycosides control group were treated with ginger phenol and tripterygium glycosides by gavage， while the control group and model control group were fed with the same amount of saline. Four weeks after the treatment， the rats were collected serum and sacrificed. The pathological of CIA joint synovial was observed by electron microscope. The expressions of IL-17 and IL-23 in serum were detected by ELISA. Results The hyperplasia of synovial tissue and angiogenesis was reduced in gingerol phenol treatment group. Infiltration of inflammatory cells and edema was improved. IL-17 and IL-23 expressions of in serum of CIA rats were significantly higher than those of the blank group （P<0.01）. Ginger phenol and tripterygium glycosides down-regulated the expressions of IL-23 and IL-17 （P<0.05， P<0.01）. Ginger phenol group was better than that of tripterygium glycosides control group （P<0.05）. Conclusion Chinese medicine ingredient ginger phenol can reduce expressions IL-17 and IL-23 in serum of CIA rats.
Key words：collagen-induced arthritis；IL-17；IL-23；ginger phenol；rats
基金项目：国家中医药管理局重点建设专科项目（2012年）；贵州省中医药民族药重点学科项目（2011年）；
贵州省科技创新人才团队项目（黔科合人才团队[2013]4033） 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以多关节慢性滑膜炎症导致滑膜纤维母细胞增生，大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润为特征的一种常见的自身免疫复杂性疾病，其发病机制目前尚不清楚。目前普遍认为RA的炎症水平与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-1β、IL-6等表达相关[1]。近年来，IL-17在自身免疫性疾病和变应性疾病发病中的作用逐渐成为免疫学研究的热点[2]。IL-23/IL-17轴在RA的发病机制中可能处于重要地位，有望成为RA治疗的新靶标[3]。前期临床研究，我们应用姜酚治疗RA取得了良好疗效[4]。本研究采用胶原诱导制备RA模型大鼠，观察中药活性成分姜酚对模型大鼠血清IL-17、IL-23的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
选取6周龄SPF级Wistar大鼠40只，雌性，体质量（160±20）g，重庆滕鑫生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2009-0004。
1.2 药物
姜酚，贵州百灵企业集团制药股份有限公司，批号20120308142128663；雷公藤多苷片，10 mg/片，湖南协力药业有限公司，批号20101101。
1.3 主要试剂与仪器
牛Ⅱ型胶原（批号C7806-2）、弗氏完全佐剂（批号F5881）、ELISA试剂盒（批号RT110371），美国Sigma公司。孵育箱（7601，GFL），洗板机（130011，AT-828），酶联免疫检测仪（DG5033A，上海同舸工贸有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组
40只Wistar大鼠按随机数字表分为正常组、模型组、姜酚组和雷公藤组，每组10只。
2.2 造模
参照文献[5]方法。电子秤称取牛Ⅱ型胶原20 mg放于试管，加入0.1 mol/L醋酸5 mL搅拌均匀，再加入弗氏完全佐剂5 mL充分混和乳化，制成2 mg/mL的Ⅱ型胶原抗原注射液，于Wistar大鼠尾根部及背部多点注射0.2 mL/只，第7、15日加强免疫2次，每日观察大鼠关节肿胀程度。
2.3 给药与取材
致炎第7日开始灌胃给药，根据人与大鼠体质量换算确定大鼠的等效剂量为姜酚和雷公藤多苷给药剂量。姜酚组给药剂量为每日0.21 mg/kg，雷公藤组每日给药剂量为7 mg/kg，给药容积5 mL/kg。正常组和模型组给予等容积生理盐水。每日分2次灌胃给药。给药第28日后，断头处死大鼠取血，离心，取上清液用于细胞因子活性测定，取大鼠膝关节滑膜及软骨，于10%的中性福尔马林中固定，用于病理检测。
2.4 关节滑膜组织形态学观察
取大鼠膝关节滑膜及部分软骨置于10%中性福尔马林中固定，8%EDTA溶液脱钙，常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色。光镜下观察滑膜细胞和血管的增生、滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润和软骨的增生及破坏等情况。
2.5 白细胞介素-17、白细胞介素-23检测
采用ELISA，按照试剂盒说明书进行操作，先加入标准品和待测样品，设阴性对照，37 ℃反应30 min温育，后洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃反应，洗板5次，加入显色液A、B，37 ℃显色10 min，加入终止液，酶标检测吸光度（OD值），重复3次，取平均值。
3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析和显著性检验，方差齐时，各组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时，则采用Tamhance's T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 病理观察
4.2 姜酚对大鼠血清白细胞介素-17、白细胞介素-23的影响
5 讨论
RA主要病理特点为慢性关节滑膜炎症，发病初期表现为滑膜充血、水肿、增厚，随着病情进展，血管翳形成，软骨和软骨下骨破坏。由于病变关节局部免疫细胞、炎性细胞、细胞因子及炎症介质等聚集，尤其是Th细胞及其分泌的致炎细胞因子在RA发病中起着非常重要的作用。
IL-17是一种促炎症细胞因子，主要由Th17细胞产生，具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞能力，能诱导活化T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎介质如IL-1、IL-6等多种细胞因子，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，最终导致骨侵蚀。IL-17与其他细胞因子如IL-1、IL-6等相互作用，导致RA病变进展[6]。本研究结果显示，模型大鼠血清IL-17表达高于正常组。
IL-23是Oppmann等[7]于2000年发现的IL-12细胞因子家族组成，由亚单位p19和p40通过二硫键形成的异源二聚体分子，在免疫调节中有独特作用。研究表明，IL-23不仅在自身免疫性疾病中发挥重要作用，而且还是RA发病过程中重要的促炎因子之一，在RA发病过程起到关键作用[8-9]。IL-23在炎性关节滑膜组织中呈高表达，引起Th17细胞分泌IL-17，刺激基质细胞产生IL-1、IL-6等致炎因子[10]。IL-23不是Thl7细胞生成所必需的，但IL-23可通过正反馈上调IL-6、IL-1β和TNF-α的表达[11]。IL-23是由巨噬细胞和树突状细胞分泌的细胞因子，对Thl7细胞的维持和扩增起重要作用，内源性或外源性高表达IL-23，均能使致敏或记忆性CD4+T细胞表达IL-17增加，两者组成了IL-23/IL-17细胞因子轴。IL-23/IL-17轴在慢性炎症的发展过程中起到了枢纽作用，其免疫通路的失调，可能会破坏自身组织和抗原的免疫耐受，导致银屑病、类风湿关节炎等自身免疫疾病的发生[12]。 姜酚是中药生姜中提取的活性物质，以6-姜酚含量最高，其生物活性也最强，通常以6-姜酚作为评价生姜及其药物品质的指标[13]。本实验结果显示，正常组大鼠关节滑膜病理切片未见炎性细胞浸润，模型组关节滑膜组织可见大量血管增生、增厚，炎细胞浸润、水肿，局部软骨组织增生。加用姜酚干预性治疗后滑膜组织血管新生及滑膜增生情况减轻，炎细胞浸润、水肿情况也得到明显改善。ELISA检测结果显示模型组大鼠血清IL-17和IL-23表达均高于正常组（P<0.01），两者表达呈正相关。姜酚组和雷公藤组大鼠血清IL-17、IL-23表达低于模型组（P<0.01），同时，姜酚组IL-17、IL-23表达低于雷公藤组（P<0.05）。表明中药活性成分姜酚通过下调模型大鼠血清IL-17和IL-23的表达，达到治疗RA的目的。
参考文献：
[1] 菲尔斯坦.凯利风湿病学[M].粟占国，唐福林，主译.8版.北京：北京大学医学出版社，2011：1089.
[2] 薛愉，邹和建，郑颂国.IL-17与自身免疫性疾病相关研究进展[J].中华微生物学和免疫学杂志，2007，27（9）：866-867.
[3] 杨帆，伍伟锋.IL-23/Th17轴与自身免疫性疾病[J].国际免疫学杂志， 2012，35（1）：35-37.
[4] 马武开，周静，刘丽敏，等.姜酚胶丸治疗类风湿关节炎的临床研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19（10）：60-61.
[5] 马武开，姚血明，陆道敏，等.姜酚对胶原诱导性关节炎的抗炎作用及其机制研究[J].中药新药与临床药理，2013，24（1）：47-51.
[6] 张雯丽，李慧，闫伟伟.类风湿关节炎患者血清IL-17、TNF-α检测的意义[J].解放军医药杂志，2011，23（5）：16-18.
[7] Oppmann B， Lesley R， Blom B， et al. Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine， IL-23， with biological activities similar as well as distinct from IL-12[J]. Immunity，2000，13（5）：715-723.
[8] 李霞.IL-23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RANKL表达中的作用[J].中国老年学杂志，2010，30（2）：161-162.
[9] 许建中，张晓强，刘占举.白细胞介素-23 在类风湿关节炎滑膜中的表达及意义[J].中华风湿病学杂志，2007，11（1）：96-98.
[10] 杜国盛，石炳毅.白介素23的生物活性与免疫调节[J].解放军医学杂志，2009，34（3）：360-362.
[11] Paradowska-Gorycka A， Grzybowska-Kowalczyk A， Wojtecka- Lukasik E， et al. IL-23 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Scandinavian J Immunol，2010，71（3）：134-145.
[12] Iwakura Y， Ishigame H. The IL-23/1L-17 axis in inflammation[J]. J Clin Invest，2006，116（5）：1218-1222.
[13] 宣伟东，卞俊，王朝武，等.生姜中6-姜酚的提取方法比较及质量控制研究[J].解放军药学学报，2008，24（4）：329-331.
（收稿日期：2013-12-18；编辑：华强）
关键词：胶原诱导性关节炎；白细胞介素-17；白细胞介素-23；姜酚；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0043-03
Effects of Ginger Phenol on IL-17 and IL-23 in Serum of Rheumatoid Arthritis Model Rats MA Wu-kai， YAO Xue-ming， HUANG Ying， TANG Fang， WANG Ying， ZHOU Jing （The Second Affiliated Hospital of Guiyang College of TCM， Guiyang 550003， China）
Abstract：Objective To observe the effects of Chinese medicine ingredient ginger phenol on expressions of IL-17 and IL-23 in collagen-induced arthritis （CIA） rats；To investigate the role and mechanism of ginger phenol in CIA rats. Methods Forty female Wistar rats were randomly divided into 4 groups：blank group， model control group， ginger phenol treatment group and tripterygium glucosides control group. After CIA was established in rats successfully， ginger phenol treatment group and tripterygium glycosides control group were treated with ginger phenol and tripterygium glycosides by gavage， while the control group and model control group were fed with the same amount of saline. Four weeks after the treatment， the rats were collected serum and sacrificed. The pathological of CIA joint synovial was observed by electron microscope. The expressions of IL-17 and IL-23 in serum were detected by ELISA. Results The hyperplasia of synovial tissue and angiogenesis was reduced in gingerol phenol treatment group. Infiltration of inflammatory cells and edema was improved. IL-17 and IL-23 expressions of in serum of CIA rats were significantly higher than those of the blank group （P<0.01）. Ginger phenol and tripterygium glycosides down-regulated the expressions of IL-23 and IL-17 （P<0.05， P<0.01）. Ginger phenol group was better than that of tripterygium glycosides control group （P<0.05）. Conclusion Chinese medicine ingredient ginger phenol can reduce expressions IL-17 and IL-23 in serum of CIA rats.
Key words：collagen-induced arthritis；IL-17；IL-23；ginger phenol；rats
基金项目：国家中医药管理局重点建设专科项目（2012年）；贵州省中医药民族药重点学科项目（2011年）；
贵州省科技创新人才团队项目（黔科合人才团队[2013]4033） 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以多关节慢性滑膜炎症导致滑膜纤维母细胞增生，大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞浸润为特征的一种常见的自身免疫复杂性疾病，其发病机制目前尚不清楚。目前普遍认为RA的炎症水平与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-1β、IL-6等表达相关[1]。近年来，IL-17在自身免疫性疾病和变应性疾病发病中的作用逐渐成为免疫学研究的热点[2]。IL-23/IL-17轴在RA的发病机制中可能处于重要地位，有望成为RA治疗的新靶标[3]。前期临床研究，我们应用姜酚治疗RA取得了良好疗效[4]。本研究采用胶原诱导制备RA模型大鼠，观察中药活性成分姜酚对模型大鼠血清IL-17、IL-23的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
选取6周龄SPF级Wistar大鼠40只，雌性，体质量（160±20）g，重庆滕鑫生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2009-0004。
1.2 药物
姜酚，贵州百灵企业集团制药股份有限公司，批号20120308142128663；雷公藤多苷片，10 mg/片，湖南协力药业有限公司，批号20101101。
1.3 主要试剂与仪器
牛Ⅱ型胶原（批号C7806-2）、弗氏完全佐剂（批号F5881）、ELISA试剂盒（批号RT110371），美国Sigma公司。孵育箱（7601，GFL），洗板机（130011，AT-828），酶联免疫检测仪（DG5033A，上海同舸工贸有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组
40只Wistar大鼠按随机数字表分为正常组、模型组、姜酚组和雷公藤组，每组10只。
2.2 造模
参照文献[5]方法。电子秤称取牛Ⅱ型胶原20 mg放于试管，加入0.1 mol/L醋酸5 mL搅拌均匀，再加入弗氏完全佐剂5 mL充分混和乳化，制成2 mg/mL的Ⅱ型胶原抗原注射液，于Wistar大鼠尾根部及背部多点注射0.2 mL/只，第7、15日加强免疫2次，每日观察大鼠关节肿胀程度。
2.3 给药与取材
致炎第7日开始灌胃给药，根据人与大鼠体质量换算确定大鼠的等效剂量为姜酚和雷公藤多苷给药剂量。姜酚组给药剂量为每日0.21 mg/kg，雷公藤组每日给药剂量为7 mg/kg，给药容积5 mL/kg。正常组和模型组给予等容积生理盐水。每日分2次灌胃给药。给药第28日后，断头处死大鼠取血，离心，取上清液用于细胞因子活性测定，取大鼠膝关节滑膜及软骨，于10%的中性福尔马林中固定，用于病理检测。
2.4 关节滑膜组织形态学观察
取大鼠膝关节滑膜及部分软骨置于10%中性福尔马林中固定，8%EDTA溶液脱钙，常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，苏木素-伊红（HE）染色。光镜下观察滑膜细胞和血管的增生、滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润和软骨的增生及破坏等情况。
2.5 白细胞介素-17、白细胞介素-23检测
采用ELISA，按照试剂盒说明书进行操作，先加入标准品和待测样品，设阴性对照，37 ℃反应30 min温育，后洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃反应，洗板5次，加入显色液A、B，37 ℃显色10 min，加入终止液，酶标检测吸光度（OD值），重复3次，取平均值。
3 统计学方法
采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析和显著性检验，方差齐时，各组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时，则采用Tamhance's T2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 病理观察
4.2 姜酚对大鼠血清白细胞介素-17、白细胞介素-23的影响
5 讨论
RA主要病理特点为慢性关节滑膜炎症，发病初期表现为滑膜充血、水肿、增厚，随着病情进展，血管翳形成，软骨和软骨下骨破坏。由于病变关节局部免疫细胞、炎性细胞、细胞因子及炎症介质等聚集，尤其是Th细胞及其分泌的致炎细胞因子在RA发病中起着非常重要的作用。
IL-17是一种促炎症细胞因子，主要由Th17细胞产生，具有强大的募集和激活嗜中性粒细胞能力，能诱导活化T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎介质如IL-1、IL-6等多种细胞因子，抑制软骨细胞合成基质，增强破骨细胞活性，最终导致骨侵蚀。IL-17与其他细胞因子如IL-1、IL-6等相互作用，导致RA病变进展[6]。本研究结果显示，模型大鼠血清IL-17表达高于正常组。
IL-23是Oppmann等[7]于2000年发现的IL-12细胞因子家族组成，由亚单位p19和p40通过二硫键形成的异源二聚体分子，在免疫调节中有独特作用。研究表明，IL-23不仅在自身免疫性疾病中发挥重要作用，而且还是RA发病过程中重要的促炎因子之一，在RA发病过程起到关键作用[8-9]。IL-23在炎性关节滑膜组织中呈高表达，引起Th17细胞分泌IL-17，刺激基质细胞产生IL-1、IL-6等致炎因子[10]。IL-23不是Thl7细胞生成所必需的，但IL-23可通过正反馈上调IL-6、IL-1β和TNF-α的表达[11]。IL-23是由巨噬细胞和树突状细胞分泌的细胞因子，对Thl7细胞的维持和扩增起重要作用，内源性或外源性高表达IL-23，均能使致敏或记忆性CD4+T细胞表达IL-17增加，两者组成了IL-23/IL-17细胞因子轴。IL-23/IL-17轴在慢性炎症的发展过程中起到了枢纽作用，其免疫通路的失调，可能会破坏自身组织和抗原的免疫耐受，导致银屑病、类风湿关节炎等自身免疫疾病的发生[12]。 姜酚是中药生姜中提取的活性物质，以6-姜酚含量最高，其生物活性也最强，通常以6-姜酚作为评价生姜及其药物品质的指标[13]。本实验结果显示，正常组大鼠关节滑膜病理切片未见炎性细胞浸润，模型组关节滑膜组织可见大量血管增生、增厚，炎细胞浸润、水肿，局部软骨组织增生。加用姜酚干预性治疗后滑膜组织血管新生及滑膜增生情况减轻，炎细胞浸润、水肿情况也得到明显改善。ELISA检测结果显示模型组大鼠血清IL-17和IL-23表达均高于正常组（P<0.01），两者表达呈正相关。姜酚组和雷公藤组大鼠血清IL-17、IL-23表达低于模型组（P<0.01），同时，姜酚组IL-17、IL-23表达低于雷公藤组（P<0.05）。表明中药活性成分姜酚通过下调模型大鼠血清IL-17和IL-23的表达，达到治疗RA的目的。
参考文献：
[1] 菲尔斯坦.凯利风湿病学[M].粟占国，唐福林，主译.8版.北京：北京大学医学出版社，2011：1089.
[2] 薛愉，邹和建，郑颂国.IL-17与自身免疫性疾病相关研究进展[J].中华微生物学和免疫学杂志，2007，27（9）：866-867.
[3] 杨帆，伍伟锋.IL-23/Th17轴与自身免疫性疾病[J].国际免疫学杂志， 2012，35（1）：35-37.
[4] 马武开，周静，刘丽敏，等.姜酚胶丸治疗类风湿关节炎的临床研究[J].中国中医药信息杂志，2012，19（10）：60-61.
[5] 马武开，姚血明，陆道敏，等.姜酚对胶原诱导性关节炎的抗炎作用及其机制研究[J].中药新药与临床药理，2013，24（1）：47-51.
[6] 张雯丽，李慧，闫伟伟.类风湿关节炎患者血清IL-17、TNF-α检测的意义[J].解放军医药杂志，2011，23（5）：16-18.
[7] Oppmann B， Lesley R， Blom B， et al. Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine， IL-23， with biological activities similar as well as distinct from IL-12[J]. Immunity，2000，13（5）：715-723.
[8] 李霞.IL-23在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞RANKL表达中的作用[J].中国老年学杂志，2010，30（2）：161-162.
[9] 许建中，张晓强，刘占举.白细胞介素-23 在类风湿关节炎滑膜中的表达及意义[J].中华风湿病学杂志，2007，11（1）：96-98.
[10] 杜国盛，石炳毅.白介素23的生物活性与免疫调节[J].解放军医学杂志，2009，34（3）：360-362.
[11] Paradowska-Gorycka A， Grzybowska-Kowalczyk A， Wojtecka- Lukasik E， et al. IL-23 in the pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Scandinavian J Immunol，2010，71（3）：134-145.
[12] Iwakura Y， Ishigame H. The IL-23/1L-17 axis in inflammation[J]. J Clin Invest，2006，116（5）：1218-1222.
[13] 宣伟东，卞俊，王朝武，等.生姜中6-姜酚的提取方法比较及质量控制研究[J].解放军药学学报，2008，24（4）：329-331.
（收稿日期：2013-12-18；编辑：华强）