H5N1高致病性禽流感病毒(H5N1 highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)严重危害禽类养殖业以及人类健康。疫苗接种是防控禽流感的有效策略,当前使用的全病毒灭活苗主要通过血凝素蛋白(HA)诱导特异性中和抗体的产生,而HA变异频繁,造成疫苗对异源毒株的保护力不足。过去几年,中国政府陆续推出了一系列来自H5 HA不同进化分支的灭活疫苗来控制H5N1禽流感病毒,但始终不能跟上病毒变异的节奏。因此,亟需一种提高禽流感灭活疫苗异源保护力的辅助制剂,弥补禽流感灭活疫苗对异源毒株保护力不足的缺陷。研究已证实流感病毒多个保守B、T淋巴细胞表位的结合能够同时刺激体液和细胞免疫反应。研究表明H5N1 AIV血凝素茎区(HA2)76-130位氨基酸高度保守,人工合成的HA2 76-130多肽免疫小鼠后能够对多个亚型流感病毒的攻击提供保护。A型流感病毒基质蛋白M2胞外区(M2e),同样也是高度保守的抗原,已经被广泛用于通用疫苗的研究。此外,核蛋白(nucleoprotein,NP)第55-69和380-393位氨基酸能够分别刺激辅助型T细胞、细胞毒性T细胞,对流感病毒的交叉保护具有重要作用。尽管表位疫苗能够引起广泛的免疫反应,单独依靠抗原表位难以抵抗H5N1 HPAIV的攻击,基于以上原因,将表位抗原作为一种辅助制剂,与H5N1灭活苗联合使用,也许是一种可行的策略。本研究选取了H5N1 AIV 4个高度保守的抗原表位包括HA2 76-130、3M2e、NP55-69以及NP380-393(HMNN)。含柔性连接序列(linker)的基因片段HMNN由公司合成,克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac-VSV-G多角体蛋白启动子下游获得p Fast-G-HMNN。按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册获得重组杆状病毒BV-HMNN。为了评价重组杆状病毒与灭活苗联合使用对异源H5N1病毒的保护效力,本研究以SPF鸡作为动物模型,肌肉注射免疫0.1 mL(1010 pfu/mL)BV-HMNN和0.3 mL对应2.3.2.1分支的Re-6灭活苗(Re-6+BV-HMNN),同时设杆状病毒野毒与Re-6灭活苗联合免疫组(Re-6+BV-WT)、Re-6灭活苗单独免疫组(Re-6)以及PBS对照组(Mock)。单次免疫后3周,用2.3.4.4分支的禽流感病毒A/goose/guangdong/14079/2013(GD/14079,H5N1)进行攻毒保护试验。实验结果表明,当与Re-6灭活苗联合免疫时,BV-HMNN不会影响灭活苗的HI效价却能显著增加M2e特异性IgG抗体滴度。在应对致死剂量的异源GD/14079病毒攻击时,Re-6+BV-HMNN免疫组保护率为100%,而Re-6免疫组仅获得了50%的保护。在排毒检测方面,Re-6+BV-HMNN组在攻毒后3、5、7天都没有从口咽和泄殖腔拭子中分离到病毒,而Re-6组在攻毒后第5天检测到1只鸡排毒,攻毒后第7天检测到3只鸡排毒。PBS对照组在攻毒后第3天检测到排毒,第5天达排毒高峰,第7天全部死亡。Re-6+BV-WT免疫组的保护效果也优于Re-6单独免疫组,主要表现为鸡的存活率更高、拭子的病毒滴度更低。综上所述,将重组杆状病毒BV-HMNN作为一种辅助制剂,与H5N1灭活苗联合使用,能够增强灭活苗的异源保护力,在应对H5N1禽流感病毒的变异以及流感大流行方面具有重要意义。