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新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种具有高度传染性的病毒性传染病。NDV能感染鸡、火鸡、鸭、鸽子和野生鹦鹉等多种禽类。由于ND给养禽业造成巨大经济损失，被国际兽疫局定为A类传染病。研究证明，在NDV感染过程中，位于病毒囊膜上的融合蛋白（F蛋白）是病毒穿入细胞，使宿主细胞产生融合和溶血的重要因子；同时也是病毒的主要保护性抗原。正因为如此，F蛋白已经成为研究新城疫基因工程疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的首选抗原。白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）是由T细胞分泌的一种重要淋巴因子，它具有促进T细胞、B细胞的增殖和分化，增强单核细胞以及NK细胞的杀伤活性等免疫调节功能。IL-2的这种免疫调节功能，还表现在能够增强疫苗诱导的免疫反应。因此，近年来IL-2常被用来作为DNA疫苗的免疫佐剂，成为免疫学研究的热点。为了深入研究新城疫DNA疫苗，提高DNA疫苗的免疫应答效果，本研究运用分子克隆技术，分别获得了NDV的F基因和鸡的IL-2基因，并在真核细胞和原核细胞中进行了表达。首先，根据GenBank中登录的F48E9株F基因序列和鸡IL-2基因序列以及真核表达质粒pcDNA3的多克隆位点，自行设计了两对F基因序列引物，它们是PFA：5’-CCCAAGCTT-ATGGGCCCCAAATCTTCTACC-3’，PFBS：5’-CGGGATCC-TCAGA TTCTTGTAGTGGCCCTC-3’，PFBF：5’-CGGGATCC-GATTCTTGTAGTGGCCC TC- 3’；两对鸡IL-2基因序列引物：它们是PIAS：5’-CGGGATCC-CTGCCATG ATGTGCAAAGTAC-3’ ，PIAF：5’CGGGATCC-GGTGGCGGACTGCCATGATGTGCA AAG-3’，PIB：5’GCTCTAGA-CTTA TTTTTGCAGATATCTCAC-3’。为了便于基因的克隆和表达，我们在引物的5’端设计了相应的酶切位点、保护位点、连接臂、起始密码和终止密码。应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，从接种NDV F48E9株的鸡胚尿囊液中扩增获得了大小约为1660bp的基因片段；从ConA诱导培养8h的鸡脾淋巴细胞中扩增获得了大小约为440bp的基因片段，分别与GenBank中登录的NDV F基因和鸡IL-2基因大小一致。经单酶切鉴定，这两个片段中均存在与NDV F基因和鸡IL-2基因相同的酶切位点。将其分别连接到pcDNA3质粒上，经质粒PCR和双酶切鉴定后，筛选获得阳性重组克隆pcDNA3-IL-2和pcDNA3-F。核苷酸序列测定分析表明，NDV F基因开放阅读框由1662个核苷酸组成，编码553个氨基酸，与已报道NDV F基因的同源性为99%；鸡IL-2基因开放阅读框由432个核苷酸组成，编码143个氨基酸，与已报道鸡IL-2基因的同源性为98%。这表明本实验已成功地克隆了<WP=4>NDV F基因和鸡IL-2基因。再通过连接臂将F基因和IL-2基因进行连接，插入到pcDNA3质粒的HindIII和XbaI多克隆位点之间，经质粒PCR、双酶切和序列测定进行了鉴定，结果表明，已成功地构建了融合基因的重组质粒，并将其命名为pcDNA3-F-IL-2重组质粒。其次，为了检测NDV F基因疫苗的体外表达效果，我们将pcDNA3-F重组表达质粒和pcDNA3空质粒经由脂质体介导的方法分别转染到COS-7细胞和p815细胞内，通过免疫荧光染色法、RT-PCR法和Western blotting法检测目的基因的表达。转染的p815细胞用G418经2~3周的克隆筛选，获得了具有G418抗性并能够稳定表达F基因的p815-F细胞株。免疫荧光染色的结果显示，F基因在转染的COS-7细胞和p815细胞株中，分别获得了一过性表达和稳定表达。RT-PCR实验结果表明，F基因被成功地整合到P815细胞株的染色体中并能正确地转录出其mRNA。Western blotting结果则表明，转染重组质粒的p815细胞裂解物在分子量约为60 000的位置出现一条特异性的染色条带，而转染空质粒的p815细胞裂解物则没有任何条带出现。最后，应用DNA重组技术，将鸡IL-2基因亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中，并转化大肠杆菌 BL21菌株。经IPTG 37℃诱导表达4 h后，SDS-PAGE 电泳结果显示，谷胱苷肽-S-转移酶（GST）与鸡IL-2的融合蛋白得到了表达，分子量约为42000，主要以包涵体形式存在。表达产物在十二烷基肌氨酸钠存在下经超声波处理，并用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱洗脱，获得了纯化的GST-IL-2蛋白，为进一步研究鸡IL-2的生物学活性奠定了基础。综上所述，本研究成功地构建了含新城疫F48E9株F基因和鸡IL-2基因cDNA的真核和原核表达重组质粒，并进一步将其导入真核细胞和原核细胞进行了表达。本研究还成功地构建了pcDNA3-F-IL-2融合基因重组质粒，这些将为进一步研究鸡IL-2和新城疫DNA疫苗提供了实验基础。