芽孢杆菌产生许多由多功能复合酶系非核糖体合成的生物活性脂肽。其中以表面活性素(surfactin)在基因水平上研究的较为深入。Surfactin是由SrfA-C三个NRPSs合成,硫酯酶/酰基转移酶SrfD刺激该过程的起始。Surfactin是一个非常强大的生物表面活性剂,可以有效降低水的表面张力。其在生物膜上具有类似生物洗涤剂的作用,并具有特殊的乳化、发泡、抗病毒和抗支原体活性。其在植物病害的生物防治和生物医学中具有潜在的应用价值。此外,脂肽可广泛应用于食品、化妆品等行业,同时可以用于提高原油采收率和生物除污。但是,通常的芽孢杆菌菌株脂肽产量很低,迄今为止,抗菌脂肽产生菌的产量一般低于1.0g/L,少的甚至在0.1g/L以下,因此提高抗菌脂肽产量显得尤为重要。目前已经有许多学者尝试采用不同的方法来增加抗菌肽的产量,但几乎所有的人都集中在菌株传统诱变、发酵优化、分离提纯或利用基因工程方法调节脂肽的合成等方面。本实验室刊、立军从药用植物黄芩中分离出一株抗菌脂肽产生菌——淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) ES-2,其对植物性病原菌、食源性病原菌和腐败菌以及真菌都有较强的抑制作用。方传记通过低能N+注入技术对该菌进行诱变,获得抗菌脂肽产量提高15.2%的高产突变菌株ES-2-4。在本研究中,以此作为出发菌株进行全基因组重组方法来迅速改善抗菌脂肽产量。同时利用RT-PCR和蛋白质组学的方法来分析出发菌株和改组高产菌株之间的差异,具体的研究描述如下：1.通过紫外线、亚硝基胍及低能N+离子注入诱变建立具有遗传多样性的亲本库.以实验室筛选的抗菌脂肽高产菌株淀粉液化芽孢杆菌ES-2-4为出发菌株,分别采用紫外线照射(UV),亚硝基胍(NTG),或低能N+离子注入诱变,然后稀释涂布于PDA平板上。通过致死曲线的测定,确定UV诱变的条件为：紫外线功率20W,垂直距离15cm,照射时间120s；NTG诱变的条件为：NTG浓度0.4mg/mL,37℃保温30min；N+离子束诱变条件为：注入能量10kev,时间10s。Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4分别采用以上三种方法进行诱变,经琼脂柱初筛、摇瓶发酵复筛后获得六株脂肽产量从40.5-45.8mg/L有所改善的突变株UV89、UV101、N114、 N32、Ni49、Ni5。它们经10代摇瓶传代实验证明,其产surfactiin性能稳定。以此作为基因组改组的亲本菌株,进行递推式原生质体融合。2.对Bacillus amyloliquefaciensES-2-4的原生质体制备、再生、灭活及融合条件进行研究。对淀粉液化芽孢杆菌原生质体制备及再生条件进行了研究。实验结果表明原生质制备的最佳条件为：菌体培养时间为4h,采用0.2mg/mL溶菌酶酶解液,在37℃的条件下,酶解处理15min。采用PDA为基础再生培养基,0.6mol/L的NaCl做为高渗稳定剂,能够使原生质体的再生率达到24.7%。采用亲本原生质体灭活的方法检出融合子,并分别对紫外线灭活和热灭活的条件进行了优化。实验结果表明原生质体紫外灭活和热灭活的最佳条件分别为：20W,15cm,60min与100℃,30min。灭活后的原生质体在pH9.0,37℃条件下,用40%PEG6000融合12min,融合率为1.04×10-5。3.利用基因组改纽技术选育surfactin高产菌株.以紫外线照射、亚硝基胍、和离子束诱变产生的六株高产突变株UV89、UV101、N114、N32、Ni49及Ni5进行递归原生质体融合。通过致死的紫外线照射灭活和热处理灭活来创建原生质体融合株库。经过两轮基因组改组,获得遗传性能稳定的高产突变株F2-38,其在1L摇瓶和19L发酵罐中surfactin产量分别是出发菌株的3.5和10.3倍。4.利用荧光定量PCI检测突变菌株中surfactin成酶基因表达量.选取surfactin合成酶基因srfA作为靶基因,16S tDN(?)作为内参基因,利用2-△△ct相对定量法检测出发菌株Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4及脂肽高产菌FMB38(F2-38)中(?)rfA基因在转录阶段的表达差异。2-△△CT目对定量分析表明,表面活性素合成酶基因(srfA)在FMB38中转录水平的表达量是ES-2-4的15.7倍,与抗菌脂肽产量的增加相一致。5.建立本实验室双向电泳体系.对2-DE方法进行改进,分别对淀粉液化芽孢杆菌蛋白质样品的制备、上样量、染色方法、胶条pH以及2-DE参数的选择等关键步骤进行优化。其优化后条件如下：染色方法选择银染；胶条pH值为4-7；24cm胶条上样量为200μg。实验发现,采用含7M尿素和2M硫脲的水化液,结合低电压脱盐的等电聚焦可以获得高分辨率、重复性好的蛋白质2-DE图谱。银染后经软件分析,在单张2-DE图谱上可以检测1000以上蛋白点。为本实验室双向电泳实验的开展奠定了基础。6.利用比较蛋白质组学的方法分析出发菌株与突变菌株的蛋白质表达差异.以上述实验为基础,研究了基因组改组高产菌株FMB38的可溶性全蛋白2-DE图谱的变化,并对差异表达的蛋白点进行质谱分析。2-DE图谱分析结果表明：在FMB38中,凝胶银染后经软件匹配,对其中丰度变化在2倍以上的51个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,有46个蛋白点得到有效地鉴定。其中有3种转录调节蛋白与脂肽合成相关。其中ComA和DegU丰度变化与其它研究报道一致,CodY丰度变化与先前的研究相悖。对所鉴定的蛋白质通过COG直系同源簇网站以及相关的文献报道对其功能进行了分类,发现这些蛋白质的功能涉及代谢、能量产生和转化、细胞分裂和染色体分配、翻译,核糖体结构和生物合成、DNA复制,重组和修复、细胞运动和分泌、翻译后修饰、一般功能预测等方面。其中明确定位的蛋白质有84.4%位于细胞质中。