地中海贫血是世界上最常见的单基因遗传病之一,同时也是我国南方地区最常见的遗传病,重症地中海贫血终生需要输血且死亡率高,产前诊断是预防重症地中海贫血唯一有效的措施。孕妇外周血胎儿有核红细胞、游离胎儿DNA、mRNA的发现为无创伤性获得胎儿遗传物质提供了新的机会,促进了无创性产前诊断的发展,获取的这些微量胎儿遗传物质已渐渐用于胎儿性别、核型、胎儿Rh血型等方面的检测,另外从受精卵分裂中取得单个胎儿细胞进行全基因组扩增技术的发展也促进了胚胎移植前产前诊断,然而这些研究都难以推广应用于临床,它们都面临较严峻的问题:即样本量少,对检测技术方法的灵敏性提出了很高的要求。芯片毛细管电泳具有快速、方便、所需样本量少等优点,将其用于产前诊断有望提高解决目前基因检测速度慢、灵敏度低、检测所需样本量较多等问题,为无创性产前诊断提供新的策略或手段。目的:我们通过芯片毛细管电泳检测β-地中海贫血,为应用于临床地中海贫血无创性产前诊断、受精卵移植前诊断打下了基础,同时我们基于片段长度差异建立了芯片毛细管电泳快速检测基因突变的技术平台,为临床疾病相关基因突变的筛查和诊断提供了一种快速、灵敏的技术手段。本研究拟开展了如下工作:1、质粒样本构建:遗传病检测的研究中病例基因组样本一般不容易获得,它是制约实验顺利进行的重要因素,如何取得足量的研究样本是本实验首先需要解决的问题。构建β-地中海贫血点突变克隆,为突变基因样本做准备。其次,通过引物延伸反应建立稳定的β-地中海贫血检测条件,完成野生型和突变型引物单独检测,初步保证检测引物工作的特异性和灵敏性。2、建立多重PCR反应体系,通过具有较高分辨能力的DHPLC完成β-地中海贫血多位点同时检测,保证六个位点多重引物延伸反应的可行性;同时也为DHPLC与芯片毛细管电泳的区分度、灵敏度的比较奠定基础。3、构建芯片毛细管电泳变性胶检测点突变的技术平台,以完成β-地中海贫血多位点野生型和突变型共同检测的目标。最终,通过芯片毛细管电泳实现β-地中海贫血快速、微量、准确地检测,为产前诊断提供一种快速、灵敏的技术手段。方法:我们的研究内容分了以下三个部分:1、构建突变质粒模板,建立稳定的引物延伸反应检测体系(1)首先建立包括六个位点的β-珠蛋白基因正常序列克隆,然后通过定点突变的方法突变克隆中正常基因位点的碱基序列,分别构建含有β-珠蛋白基因突变位点的基因克隆,通过测序进行验证。(2)设计检测各位点的引物,不但要避免引物间二聚体形成,同时要使所有引物长度、退火温度等相近,以保证多重引物延伸反应的顺利进行。为提高引物延伸反应的特异性,采用三温循环反应程序,并对影响检测反应的各因素进行研究和优化,包括反应程序、引物浓度、引物序列、离子浓度、退火温度、人工错配引物等影响因素的研究,以提高检测反应的特异性和灵敏性,初步建立具有区分正常基因型和突变基因型能力的检测体系。(3)为了后续能在一个检测系统同时区分野生型和突变型扩增产物,我们在野生型检测引物5’端加上10个或20个非特异性的碱基序列,基于核酸片段长度差异在单管反应中可同时区分野生型和突变型,以此同时辨别六个位点的纯合子和杂合子基因型。2、多重引物延伸反应检测β-地中海贫血建立多重引物延伸反应体系,将六个位点的野生型、突变型引物同时在单管中反应,采用具有较高分辨能力的DHPLC检测多个位点的扩增产物,通过多重引物延伸实验完成β-地中海贫血六个位点同时检测。3、通过芯片毛细管电泳检测β-地中海贫血(1)构建双通道芯片毛细管电泳检测平台,包括毛细管电泳芯片、激光共聚焦检测装置、信号收集输出装置的搭建和优化;然后对检测胶的制作工艺、浓度等条件进行研究,提高其对长度差异核酸片段的区分能力;通过对核酸酶切产物、微卫星标准品的检测,评估系统的区分度和重复性。(2)通过多重引物延伸反应将β-地中海贫血六个位点的野生型和突变型引物同时检测每个待检样品。采用荧光Cy3和Cy5分别标记地中海贫血标准品和待检品,通过芯片毛细管电泳双通道同时检测,将待检样品与标准品进行对位比较,以辨别各样品的基因型,包括正常基因型、杂合子、突变纯合子的检测,通过临床病例样本完成β-地中海贫血芯片毛细管电泳检测平台的验证。(3)收集孕妇夫妻双方均为地中海贫血患者或携带者的家庭进行产前诊断,分别获取孕妇外周血浆、羊水或脐血样本,采用试剂盒及芯片毛细管电泳检测平台同时进行β-地中海贫血的产前诊断,分析和比较不同检测方法得到的胎儿基因型结果。结果1、通过定点突变方法成功构建了β-地中海贫血六个突变位点克隆,经测序完全正确。引物延伸反应体系的研究中,设计的引物工作较好,无明显引物二聚体产生。采用三温循环反应较传统单温循环反应具有较高的特异性,在三温循环中退火温度、循环次数对反应的扩增效率及特异性有明显的影响,在我们的研究中发现第二循环反应温度采用67度时适合所有位点检测引物的扩增,且扩增效率高、无非特异性扩增;同时引物延伸反应还受离子浓度、引物浓度、引物序列等因素的影响,对以上因素的调节有助于建立最佳的反应检测条件。在实验中为了降低单碱基差异检测的难度、提高检测引物的特异性和辨别力,我们在引物序列中引入人工错配碱基,发现其增大了野生型和突变型引物间的差异,解决了单碱基差异检测中非特异性扩增的难题。通过凝胶电泳的检测初步建立了具有较高稳定性、特异性的检测体系,以β-地中海贫血患者样本为检测模板上进行了验证,每个样品检测结果都符合试剂盒检测结果或测序结果。在引物加尾实验的研究中,我们发现加入10个或20个非特异的T碱基不但不会影响反应的退火温度,而且也没有造成引物二聚体,可较好的工作而不影响多重引物延伸反应。可用于下一步基于片段长度通过芯片毛细管检测的研究。2、通过多重引物延伸反应对β-地中海贫血六个位点同时扩增,采用DHPLC检测不同位点扩增产物,调节洗涤液的浓度及检测时间提高DHPLC检测的区分度,实现了六位点野生型或突变型同时进行检测。3、通过芯片毛细管电泳检测β-地中海贫血:构建了芯片毛细管电泳变性胶检测技术平台,在材料方面我们采用高分子为原材料可下降检测成本及实现再利用;检测装置为公司自产的激光共聚焦扫描仪改装而成,采用共聚焦光路,大大提高了检测底限,同时仪器还集成了632nm和532nm两种激光器以及各自的滤光片,因而能够实现Cy5、Cy3双通道同时采集;新的光路采用了激发光入射到芯片管道上,大部分的反射光经过反射镜的透射孔透射出去。其有两个优点,第一是反射镜上有一个透射孔,可以透过绝大部分的反射激光,降低背反射激光的影响;第二是采用共聚焦光路,使得非焦点位置的杂散光不能透过针孔,再一次降低了背景噪音。通过变性胶浓度以及制备程序等方面优化提高芯片毛细管电泳检测能力,采用3%的HPC胶时,检测区分能力较好,可区分100-200bp和300-400bp间相差4bp的不同长度核酸片段。在检测β-地中海贫血标准品的实验中,完成了对100-600bp间相差10bp不同长度片段的区分,并且建立的标准品和待检品双通道检测体系,其稳定性、重复性好,通过芯片毛细管电泳完成了临床病例样本多位点同时检测,可检测六个位点纯合子、杂合子基因型,芯片毛细管电泳检测所有样本的结果与试剂盒检测的结果完全一致。此检测系统平台仅需要0.5ng/μl的基因组样本,1μl的检测样本(0.04nM),检测时间只需要200s,实现了快速、微量检测的目标。将检测系统进行β-地中海贫血无创性产前诊断的研究,检测的结果与脐血或羊水基因检测结果一致。其所需样本量非常少、快速的优点为无创性产前诊断方法提供的一种新的选择。结论1、完成了从质粒构建、引物延伸反应到遗传病检测一套完整的方法体系,点突变质粒的构建为解决遗传病检测样本的不足提供了一种便捷的方法,引物延伸反应影响因素的全面研究为快速建立引物延伸反应条件奠定了基础,这些方法可用于其他相关遗传病检测的研究和应用。同时建立了β-地中海贫血多重引物延伸反应采用凝胶进行检测的方法,此方法简单、材料普通而便宜,可用于基层医院的筛查使用。2、建立了芯片毛细管电泳检测遗传病基因点突变的技术平台,完成了β-地中海贫血微量样品的快速检测,为外周血胎儿游离DNA及胚胎移植前遗传病诊断等微量标本要求的无创性产前诊断提供一种新的检测途径,同时也为其他遗传病的快速检测奠定了基础。3、我们将基于基因片段长度差异检测的方法进行了比较,包括琼脂糖凝胶电泳、HPLC、芯片毛细管电泳,显示了芯片毛细管电泳是一种快速、灵敏度高、区分能力强的基因突变检测工具。