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目的:1.建立一种简便有效的体外分离、纯化、培养、扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)的方法,并研究其生物学特性,为涎腺组织工程提供理想的种子细胞。2.探索一种有效的体外培养颌下腺细胞(submandubularglandcells,SMGCs)的方法,观察细胞形态,研究其生物学特性,为体外诱导BMSCs转分化为涎腺细胞提供实验基础。3.用SMGCs裂解液诱导骨髓间充质干细胞,并评价转分化后的BMSCs的生物学功能。
方法:1.全骨髓贴壁培养法分离纯化SD大鼠BMSCs,在体外培养和连续传代,倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化;测定原代和传代BMSCs的生长曲线,研究其生物学特征。2.酶消化法分离并培养新生SD大鼠的SMGCs,研究其生物学特性,测定各代腺泡细胞分泌α-淀粉酶的量。3.取SMGCs分泌α-淀粉酶显著一代制成细胞裂解液,诱导BMSCs转分化,细胞免疫组织化学法鉴定诱导后的BMSCs分泌α-淀粉酶的功能。
结果:1.用全骨髓贴壁培养法分离、纯化SD大鼠的BMSCs,并进行体外培养和扩增,在倒置显微镜下观察培养的BMSCs形态变化,发现培养的细胞符合典型的BMSCs形态学表现,即细胞呈梭形,旋窝状排列。绘制BMSCs的生长曲线,发现BMSCs原代生长潜伏期较长,一般为4天左右,9-10天进入对数生长期,14天左右细胞生长缓慢,进入平台期。而传代细胞,生长潜伏期较原代缩短,一般为2天左右,5天左右进入快速生长期,9天左右生长速度变缓,且随着传代次数的增加,细胞数目有所减少,从生长曲线图来看,P2到P5代细胞生长处于顶峰期,P6代细胞均数开始减少。经统计学分析,结果表明,P2至P6代细胞数相差无统计学意义P>0.05,P2与P1,P10代细胞数相差有显著差异P<0.05。
2.本实验用酶消化法分离、培养SD大鼠下颌下腺细胞,在培养液加入如表皮生长因子、转铁蛋白等促细胞生长因子后,所培养的下颌下腺细胞生长、增殖能力较强,倒置显微镜下观察下颌下腺细胞的形态,发现2天后即开始形成克隆,呈卵圆形,10天后细胞增殖,形成单一的细胞层。传代后,细胞继续培养形成“鹅卵石”样结构。经细胞免疫组织化学鉴定,荧光显微镜下显示出胞质为绿色,核为蓝色的下颌下腺腺泡细胞。
3.BMSCs在下颌下腺腺泡细胞裂解液的诱导作用下,实验组与对照组相比形态发生了明显变化,实验组的BMSCs由最初的长梭形逐渐向多角形的腺泡样细胞转变。细胞免疫组化学染色结果显示,诱导一周后实验组BMSCsα-淀粉酶阳性,而对照组BMSCsα-淀粉酶阴性。
结论:1、采用全骨髓贴壁筛选法分离获取的大鼠BMSC细胞多,成活率较高,增殖速度较快。可以作为培养大鼠BMSCs的常规方法。本研究结果将为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用奠定基础。
2、建立规范的颌下腺细胞培养体系,对颌下腺组织工程化的研究及诸多有关颌下腺的离体试验,有着非常重要的价值。
3、本研究通过裂解液诱导法,体外模拟腺泡细胞微环境,观察下颌下腺细胞微环境对BMSCs向下颌下腺细胞转分化所起的作用,以获取涎腺组织工程中的种子细胞。