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肺癌是目前临床上最常见的恶性肿瘤之一,拥有极高的发病率和死亡率,以18.4%的死亡率位居各种恶性肿瘤致死首位。目前针对肺癌的主要治疗手段已经取得较大进步,例如手术切除、化学治疗、放射治疗、靶向治疗及免疫治疗等方式能够使患者的存活率得到大幅延长,但因为肺癌的发病机制不详,缺乏行之有效的防治有段,使得其发病率和死亡率仍然居高不下。依据组织病变,可将肺癌分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）,而在肺癌患者的病理类型中,NSCLC占据80%左右。因此,探索NSCLC的发生机制,对其中的关键调控基因实现靶向治疗对于挽救患者生命具有急迫的意义。本课题组前期研究（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28112369/）发现,编码人类H3类组蛋白的基因HIST1H3D,能够促进肺癌的发生,在对HIST1H3D敲减后,转录组测序基因分析发现敲减组中FIGNL1的表达下调1.6倍,说明FIGNL1可能与肺癌的发生有关。查阅相关文献发现,FIGNL1属于多种细胞活动相关 ATP 酶（ATPases Associated with diverse cellular Activities,AAA-ATP）中的一种减数分裂蛋白。FIGNL1可以对微管结构进行修饰和重构,进而对包括细胞形态维持、细胞分裂与迁移、胞内物质输送及信号传导等生物学过程具有重要的调节功能。有研究表明,FIGNL1基因对DNA断裂修复过程是极为重要的,在人体骨肉瘤细胞中,人FIGNL1的FRBD结构域与重组酶RAD51（同源重组的关键酶）互作,从而在有效的染色体同源重组介导的DNA修复中发挥作用,进而促进骨肉瘤细胞的增殖。也有研究报道,FIGNL1具有促进DNA复制和细胞分裂的能力,并对癌细胞的迁移具有重要的调控作用。鉴于FIGNL1在多种癌症发生中均显示出促癌活性,但FIGNL1在NSCLC中的研究尚未见报道,结合本课题组的前期研究发现FIGNL1有可能促进肺癌的发生,而且,本课题组进一步进行了细胞及临床标本的预实验,细胞预实验方面,首先应用荧光定量PCR技术检测FIGNL1在常见肺癌细胞系的表达情况,发现FIGNL1在H1299、A549和H1975细胞中高表达。接下来,临床标本预实验方面,分别选取5例肺腺癌和5例肺鳞癌的癌组织及癌旁组织标本,采用免疫组织化学方法检测FIGNL1在其中的表达情况,结果发现FIGNL1在癌旁组织中表达阴性,在肺癌组织中表达阳性,且呈高表达。综上所述,细胞及临床标本的预实验提示FIGNL1在NSCLC中高表达,FIGNL1有可能促进NSCLC的增殖。因此,本课题主要从影响NSCLC发生的基因调控角度出发,重点研究FIGNL1基因在NSCLC发生中的作用和可能的分子机制。研究目的:1.明确FIGNL1基因与非小细胞肺癌的临床相关性;2.阐明FIGNL1基因在非小细胞肺癌发生中的作用;3.揭示FIGNL1基因促进非小细胞肺癌发生的分子机制。研究方法:1.FIGNL1在非小细胞肺癌样本中的表达及其临床意义1.1选取109例非小细胞肺癌样本及对应的癌旁组织标本;1.2免疫组织化学检测FIGNL1基因在非小细胞肺癌组织及癌旁组织的表达;1.3结合患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移情况、TNM分期等临床资料,分析FIGNL1在非小细胞肺癌中表达的临床意义。1.4根据患者的生存时间进行生存分析,分析FIGNL1对非小细胞肺癌患者生存期的影响。2.FIGNL1基因在非小细胞肺癌发生中的功能学检测2.1拟进行本研究的细胞系选择:采用荧光定量PCR、蛋白印迹（Western Blotting,WB）技术分别在转录和翻译水平检测FIGNL1在常见肺癌细胞系中的表达,选择在转录和翻译水平表达均较高的细胞系（H1299和A549）进行下面的细胞学实验。2.2构建FIGNL1基因RNAi慢病毒载体,并获得稳定转染细胞系2.2.1 针对FIGNL1基因序列,设计RNA干扰靶点序列;2.2.2 合成含干扰序列的双链oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上;2.2.3 通过测序验证正确的RNAi干扰载体,将有效干扰载体以及对照组载体分别包装成shFIGNL1慢病毒以及shCtr1慢病毒,并通过滴度测定进行质控;2.2.4 将处于对数生长期的H1299及A549细胞进行胰酶消化并重悬制成细胞悬液;2.2.5 将其接种于6-well中,根据细胞的MOI值,加入适量的shFIGNL1或shCtr1慢病毒载体,并继续贴壁培养至对数期,扩大细胞种群以备后续实验;2.2.6 采用qPCR及WB技术进行FIGNL1基因敲减效率测定。2.3构建FIGNL1基因过表达质粒,并获得稳定转染细胞系2.3.1 使用BamHI和EcoRI按照相应的酶切体系和反应条件将骨架载体pLenO-GTP-C-3×Flag 线性化;2.3.2 使用cDNA模板和引物H-FIGNL1（CDS）-S/A,按照相应的反应程序,将外源DNA克隆出来并得以回收和纯化;2.3.3 将线性化的骨架载体pLenO-GTP-C-3×Flag和纯化的DNA连接起来,并对重组载体进行酶切验证;2.3.4 将构建完成的重组载体转化感受态DH5 α细胞,以大量获取高纯度无内毒素的质粒;2.3.5 将FIGNL1过表达质粒及阴性对照质粒转染肺癌细胞H1299和A549;2.3.6 采用qPCR及WB技术进行FIGNL1基因过表达效率测定。2.4 FIGNL1基因对肺癌细胞增殖、周期、凋亡、迁移、侵袭及成瘤能力的影响2.4.1 实验组别的设计干扰载体实验组别:采用shFIGNL1慢病毒载体干扰肺癌细胞内FIGNL1基因的表达（shFIGNL1组）,同时采用感染了 shCtr1慢病毒质粒的细胞作为对照组（shCtr1 组）。过表达质粒实验组别:FIGNL1过表达质粒转染肺癌细胞,增加FIGNL1基因的表达（OE组）,阴性对照质粒转染肺癌细胞作为对照组（NC组）。2.4.2 通过CCK8检测方法,对细胞的生长情况进行检测;2.4.3 通过碘化丙啶（PI）流式分析法对细胞周期分布情况进行检测,以及采用Annexin V流式检测技术对两组细胞的凋亡情况进行分析;2.4.4 平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力;2.4.5 划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力;2.4.6 裸鼠成瘤实验2.4.6.1 用shFIGNL1和shCtr1载体分别转染肺癌细胞株H1299后培养,配制成细胞悬液;2.4.6.2 将两组细胞悬液分别皮下注射至裸鼠右前肢腋下;2.4.6.3 5-7天后,观察成瘤情况,并每隔一天测量一次肿瘤大小、裸鼠体重,至皮下注射后21-28天;2.4.6.4 处死裸鼠并取出瘤体进行称重;2.4.6.5 比较实验组和对照组瘤体体积和重量差异。3.FIGNL1促进肺癌发生的分子机制研究3.1分别用shFIGNL1和shCtr1载体转染H1299细胞株;3.2 用 Trizol一步法提取细胞总 RNA,用 Affymatrix GeneChip（?）primeview human基因芯片检测差异表达基因;3.3对差异表达基因进行信号通路富集,尤其关注FIGNL1促增殖的信号通路,并选取相关的差异表达基因进行qPCR和WB验证,分析其可能的机制。研究结果:1.FIGNL1在非小细胞肺癌患者的肺癌组织中的表达量显著升高,结合临床资料分析发现淋巴结转移情况和TNM分期与FIGNL1的表达有关,淋巴结存在转移的患者,FIGNL1的表达较高,TNM分期相对较晚（ⅡB+Ⅲ期）的患者,FIGNL1的表达相对较高。而FIGNL1的表达与性别、年龄、肿瘤大小、病理类型等无相关性,FIGNL1的表达水平与非小细胞肺癌患者的生存时间无相关性。2.FIGNL1基因在肺癌细胞株H1299和A549中的转录和翻译水平表达均较高,接下来选择H1299和A549进行细胞学实验。3.CCK-8实验结果提示FIGNL1基因被敲减后对细胞生长速率有极为显著的抑制作用,而当该基因被过表达恢复后,细胞生长速率即得以恢复。4.FIGNL1基因对肺癌细胞周期调控具有重要意义,抑制其表达会造成大量细胞被阻滞在G1期（P<0.01）,而当恢复表达后,这种情况会得以逆转（P<0.05）。5.FIGNL1基因对肺癌细胞凋亡也具有重要意义,当该基因表达被抑制后,凋亡细胞占比显著提高（P<0.001）,而当被恢复表达后,凋亡细胞占比显著下降（P<0.01）。6.FIGNL1基因对克隆形成、划痕修复能力以及迁移和侵袭能力上均有不同程度的促进作用,当该基因被抑制表达后,上述几方面能力被显著衰弱（P<0.05）,而当表达被恢复后,两组细胞的克隆形成能力,A549细胞在24h的划痕修复能力以及侵袭能力有恢复趋势,但与对照组相比,无明显统计学差异（P>0.05）,而在两组细胞的迁移、H1299细胞的划痕修复以及侵袭能力方面,这些存活力指标均得以恢复（P<0.05）。7.FIGNL1基因对于在体肿瘤组织的形成与发展确实起到重要的促进作用,当小鼠被接种了 FIGNL1表达被干扰的肺癌细胞系后,肿瘤生长速度相比对照组实现了显著抑制（P<0.01）;8.转录组基因分析共发现754个差异表达基因,其中563个上调基因,191个下调基因,其中下调的基因对细胞的生长影响更大,且进一步分析发现下调的基因在DNA复制及细胞周期等功能通路显著富集,选取下调基因中的PCNA、MCM2、MCM4、SKP2等4个基因进行转录和翻译水平的验证,发现PCNA、MCM2、SKP2这三个基因在转录和翻译水平的表达均有不同程度的下降,而MCM4在转录水平的表达有下降,在蛋白表达水平,未出现明显降低,提示FIGNL1有可能是通过PCNA、MCM2、SKP2等因子促进肺癌的发生。结论:1.FIGNL1在肺癌组织中高表达,淋巴结存在转移、TNM分期相对较晚（ⅡB+Ⅲ期）的患者,FIGNL1的表达相对较高,FIGNL1的表达水平与非小细胞肺癌患者的生存时间无相关性。2.FIGNL1的表达水平与非小细胞肺癌的生长、增殖、迁移、侵袭呈正相关。3.FIGNL1对于裸鼠体内的肿瘤形成具有显著的促进作用。4.FIGNL1促进非小细胞肺癌发生的过程中,PCNA、MCM2和SKP2等因子有可能是受FIGNL1基因调控的下游信号分子。