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近年来,昆虫化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)研究颇受关注,在生化特性、分子结构、生理功能和研究方法等方面均取得了一系列重要进展,为阐明昆虫与环境之间的信息联系本质,开拓害虫防治和益虫利用新途径提供了重要基础。本论文对菜粉蝶(Pieris rapae)的PrapCSP和萝卜蚜(Lipaphis erysimi)的LeryCSP两个基因进行了克隆,并对PrapCSP和LeryCSP进行了原核表达研究。
比较已报道的鳞翅目昆虫和同翅目昆虫的化学感受蛋白的基因序列,根据保守区分别设计了两个基因的引物,再分别以菜粉蝶和萝卜蚜的总RNA为模板,利用RT-PCR和RACE技术,分别克隆得到PrapCSP和LeryCSP cDNA的全长序列。序列测定和结构分析表明:PrapCSP的阅读框全长为378bp,编码125个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为14.30kD和6.31;LeryCSP的阅读框全长438bp,编码145个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为16.57kD和9.03。
氨基酸序列同源性分析表明,克隆获得的PrapCSP和LeryCSP基因是未报道基因,GenBank登录号分别为EU136569和EU077498。两个基因的氨基酸序列中分别有4个保守的半胱氨酸位点。推导的氨基酸序列与已报道的几种化学感受蛋白高度同源(PrapCSP:66.4%~3008%;LeryCSP:91.7%~35.9%)。
运用生物信息学技术对推测的PrapCSP和LeryCSP的氨基酸组成和亲脂性进行了分析,蛋白组成的酸性氨基酸所占蛋白质分子量分别为19.07%、13.70%,利用频率分别为17.60%、13.10%;碱性氨基酸所占蛋白质分子量分别19.60%、20.35%,利用频率分别为16.80%、17.24%:极性氨基酸所占蛋白质分子量分别为23.55%、28.03%,利用频率分别为22.40%、26.90%;疏水性氨基酸所占蛋白质分子量分别为30.39%、32.13%,利用频率分别为33.60%、35.17%。整个蛋白分子呈亲水性,但在成熟蛋白序列中菜粉蝶在第0-20位、40-45位、85-90位和120-125位氨基酸表现较强亲脂性;萝卜蚜在第0-20位、30-33位、45-60位氨基酸表现较强亲脂性。预测了蛋白质二级结构,主要由α螺旋构成;采用同源模建方法,初步预测了蛋白质三级结构,PrapCSP和LeryCSP高度折叠,整个分子呈球状,主要由α螺旋构成。并利用PrapCSP和LeryCSP的最佳结构模型分别与闹羊花素Ⅲ、骆驼蓬碱和鱼藤酮进行了分子对接,PrapCSP可以与闹羊花素Ⅲ、骆驼蓬碱和鱼藤酮对接成功,而LeryCSP只与骆驼蓬碱对接成功。
构建了PrapCSP和LeryCSP基因原核表达载体pET28a-PrapCSP和pET28a-LeryCSP,经SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导后,PrapCSP和LeryCSP都能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其中PrapCSP电泳检测到一条约14kDa大小的外源蛋白,LeryCSP电泳检测到一条约16kDa大小的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相当,蛋白表达量很大。PrapCSP表达得到蛋白以可溶性蛋白的形式存在,但是LeryCSP表达得到蛋白以包涵体的形式存在。本研究中将菜粉蝶成虫化学感受蛋白PrapCSP和萝卜蚜化学感受蛋白的LeryCSP整合入原核表达载体表达,得到的重组蛋白为下一步获得大量PrapCSP和LeryCSP重组蛋白,进一步研究PrapCSP和LeryCSP蛋白的结构及与配体的结合关系提供了基础。
在系统研究的基础上,对总RNA提取对基因克隆结果的影响、氨基酸序列特点、蛋白三级结构与某些非挥发性植物次生物质的结合、原核表达过程中包涵体的出现等进行了讨论,初步明确了昆虫化学感受蛋白的结构特点以及与某些非挥发性植物次生物质的结合方式,为研究昆虫的产卵忌避作用机制,开发基于作用靶标的新型、高效、安全的“昆虫产卵忌避剂”提供理论基础。