【摘 要】
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抗缪勒氏管激素(Anti-Müllerian Hormone;AMH)又称缪勒氏管抑制物,是胚胎发育阶段控制性腺分化的重要激素之一。主要负责雄性动物早期胚胎输卵管性腺前体的退化,以及雌性家禽早期胚胎右侧输卵管的退化。但是AMH在胚胎发育早期阶段对性腺分化和输卵管前体退化的分子学机制依然尚未明确。近年来基因组精确编辑技术的突破性进展为AMH功能研究提供了良好的技术支持。尤其是CRISPR/Cas9的
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抗缪勒氏管激素(Anti-Müllerian Hormone;AMH)又称缪勒氏管抑制物,是胚胎发育阶段控制性腺分化的重要激素之一。主要负责雄性动物早期胚胎输卵管性腺前体的退化,以及雌性家禽早期胚胎右侧输卵管的退化。但是AMH在胚胎发育早期阶段对性腺分化和输卵管前体退化的分子学机制依然尚未明确。近年来基因组精确编辑技术的突破性进展为AMH功能研究提供了良好的技术支持。尤其是CRISPR/Cas9的出现,使得内源性影响AMH的表达成为可能。作为RNA引导的、具有切割酶活性的核酸酶系统,CRISPR/Cas9的工作效率很大程度上依赖于sgRNA的靶向效率和外源核苷酸的转导效率。因此本次试验从提高sgRNA的靶向能力和SpCas9的转导效率两方面对靶向鸡AMH基因的CRISPR/Cas9敲除系统进行优化,从而提高CRISPR/Cas9对鸡AMH基因的编辑效率。1、为了提高sgRNA对鸡AMH基因的靶向效率,本试验构建了靶向鸡AMH基因第一外显子的成对sgRNA敲除载体pX330-U6-AMHsg1_dBsaI-CBh-SpCas9和pX330-U6-AMHsg2_dBsaI-CBh-SpCas9,以及基于SSA工作原理的相应SSA-RPG双荧光报告载体pB-CMV-DsRed-CAG-AMH12.200bp repeat.Puro-T2A-GFP,使用Lipofectamine 3000转染试剂转染鸡成纤维细胞系(DF-1细胞)。通过SSA-RPG报告载体荧光初步评估了CRISPR/Cas9系统的工作效率,经过Puromycin以3μg/mL的浓度筛选8天可以明显富集阳性细胞。TA克隆测序表明:成对sgRNA设计的CRISPR/Cas9系统对鸡AMH基因的打靶效率(83%)相较于传统的单sgRNA设计(40%)有着明显的提升。2、为了提高CRISPR/Cas9在细胞的转导效率,本试验采用Ad-Easy腺病毒包装系统,将SpCas9编码序列通过骨架质粒的多克隆位点(Multiple Cloning Site,MCS)构建进入腺病毒穿梭载体pAdTrack_CMV中。通过BJ5183大肠杆菌感受态的同源重组,获得携带有SpCas9编码序列的重组腺病毒载体pAdEasy-SpCas9,酶切线性化后转染293A细胞,在细胞中包装出携带SpCas9的重组腺病毒reAdv-SpCas9。除此之外,本试验构建了成对sgRNA表达载体msgRNA-AMH12和基于单链退火(Single Strand Annealing,SSA)工作原理的SSA-RFP单红光报告载体pB-puro-RFP.SSA-AMH_target12。将构建的质粒与重组病毒共转293T细胞。reAdv-SpCas9重组腺病毒表达的SpCas9蛋白在msgRNA-AMH12载体表达的成对sgRNA引导下成功对pB-puro-RFP.SSAAMH_target12载体中的鸡AMH靶序列打靶。综上所述,通过腺病毒介导的SpCas9配合成对的sgRNA设计可以明显提高CRISPR/Cas9的转导效率和鸡AMH基因的打靶效率。本试验的结果为活体水平基因功能的研究提供了具有高侵染活性的SpCas9表达载体;成对sgRNA结构的导向RNA设计为靶基因的高效敲除提供了新的思路。
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