深海环境独特,含有大量的特殊生境,如热液、冷泉、深渊等,这些特殊生境中的微生物为了适应环境而演化出独特的生理生化特性,如产生具有独特生物活性的酶等。为了筛选在低温条件下具有较好生物活性的酶类,本研究首先从深海冷泉沉积物中分离筛选具有产酶能力的细菌菌株,然后针对在低温下具有较好酶活的菌株进行分离鉴定、相应酶的分离纯化及酶学性质测定。本研究从深海冷泉沉积物中筛选出50株具有蛋白酶活性的菌株,根据16S r RNA序列分析结果,它们分别属于Bacillus、Pseudoalteromonas、Vibrio和Alteromonas四大类。此外,本研究还对它们产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力进行了检测,其中属于Bacillus属的gcc-1菌株在低温条件下具有较高的蛋白酶活性,属于Pseudomonas属的gcc21菌株在低温条件下具有较高的脂肪酶活性。为进一步了解gcc-1菌株产生的低温蛋白酶,本研究通过硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析和凝胶柱层析等方法对该蛋白酶进行了分离纯化,SDS-PAGE检测表明纯化后的蛋白酶大小约为28 k Da。生理生化测定表明,该蛋白酶在10℃-80℃和pH 6.5-11.5的范围内具有较高的活性和稳定性,最适温度为40℃,最适pH值为8.5,且在10℃的低温条件下仍保持较高活性。此外,该蛋白酶在不同的表面活性剂、有机溶剂、氧化剂H2O2和商业洗涤剂存在下均表现出良好稳定性,表明该蛋白酶在洗涤剂的添加行业具有广泛的应用前景。根据16S r RNA序列分析,具有低温脂肪酶活性的菌株gcc21为一株疑似新菌,为进一步鉴定该菌株,本研究通过基因组序列分析和生理生化性质测定对该菌株进行多相分类学鉴定,研究结果表明该菌株为Pseudomonas属中一个新种,并被命名为Pseudomonas marinensis。由于菌株gcc21具有较强的低温脂肪酶活性,且该菌株基因组中含有两个低温脂肪酶（Lipase 1和Lipase 2）。为进一步了解这两个脂肪酶的活性,本研究将Lipase1和Lipase 2在大肠杆菌中进行异源表达和纯化,并对其生理生化性质进行了相关研究。结果表明,Lipase 1和Lipase 2的最适催化温度均为4℃,但Lipase 2酶活活性和稳定性均高于Lipase 1,表明Lipase 2具有较好的应用前景。根据脂肪酶催化中心氨基酸突变后活性测定,表明Lipase 1和Lipase 2中的丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的催化三联体是维持脂肪酶酶活性所必需的。此外,脂肪酶氨基酸序列系统发育树分析表明Lipase 1和Lipase 2均属于脂肪酶的家族Ⅲ。综上所述,本文筛选到的深海冷泉菌株gcc-1具有较好的低温蛋白酶活性,而菌株gcc-21不仅为一株新的菌株,且具有较好的低温脂肪酶活性。因此,深海冷泉不仅是分离筛选潜在独特低温酶的重要宝库,也是筛选新型菌株的重要来源。