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哺乳动物卵泡在发育过程中,除少量发育成熟并排卵外,绝大部分发生退化、闭锁。研究表明,卵泡闭锁的主要诱因是颗粒细胞凋亡。目前已有人、鼠、牛、猪、绵羊和山羊等动物的颗粒细胞凋亡及其调控机理的研究报道,但对水牛卵泡颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的分子机制研究较少。为此,本试验首先对不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因及miRNA的表达规律进行了分析,以了解颗粒细胞凋亡与卵泡闭锁的关系,初步阐明水牛卵泡闭锁的分子机制。其次,通过研究雌二醇(E2)对体外培养的水牛颗粒细胞凋亡、细胞周期、凋亡相关基因和miRNA表达的影响,探索E2在调控水牛颗粒细胞凋亡过程中的作用,为优化颗粒细胞体外培养条件以及进一步了解水牛卵泡闭锁机理奠定基础。一、不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA的表达。1.采用HE染色、DNA ladder分析和Tunel法检测了HF、EF和PF三种不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞的凋亡状态。结果发现,HF卵泡腔中无脱落的颗粒细胞,其中的颗粒细胞基因组DNA没有出现明显的DNAladder,细胞凋亡率为9.32%。EF卵泡内壁结构较松散,卵泡腔中可见到有少量脱落的颗粒细胞,其颗粒细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,细胞凋亡率为17.24%。PF颗粒细胞大部分脱落于卵泡腔中,卵泡内壁退化严重,基因组DNA降解严重,出现明显的DNA ladder,凋亡率达20.26%。2.利用qRT-PCR方法分析了不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA的表达。结果显示,死亡受体通路相关的Fas等基因在HF、 EF、PF三种颗粒细胞中均有表达,且随着卵泡闭锁程度加深,其表达量显著升高(P<0.05)。TNFα基因在HF颗粒细胞中不表达而在EF和PF中表达,TRAIL基因在三种颗粒细胞中均不表达。所检测的线粒体通路相关基因在三种颗粒细胞中均有表达,其中Bcl-2、Bcl-xl和MCL-1基因在HF颗粒细胞表达最高,随着卵泡闭锁程度加深,其表达量逐渐降低；Bax等基因在PF颗粒细胞表达最高,且随着卵泡闭锁程度加深其表达量逐渐升高。内质网应激通路相关基因在三种颗粒细胞均有表达,且随着卵泡闭锁程度加深其表达量逐渐升高。所检测的包括miR21-5P在内的16条miRNA在HF、EF和PF颗粒细胞均有表达,其中miR21-5P等10条miRNA的表达水平随着卵泡闭锁程度加深呈先升高后下降的趋势；miR99a-5P等6条miRNA的表达量随着卵泡闭锁程度加深而逐渐降低。3.运用免疫组化方法分析了细胞凋亡相关蛋白Fas和Caspase3在不同闭锁程度水牛卵泡颗粒细胞中的表达。结果显示,Fas和Caspase3蛋白在HF、EF、PF颗粒细胞中均有表达,且随着卵泡闭锁程度加深其表达水平逐渐增强。二、E2对体外培养水牛颗粒细胞凋亡的影响及其调控机制。1.采用Tunel法分析了E2对体外培养水牛颗粒细胞凋亡的影响。结果发现,浓度为10-5mol/L的E2能够有效抑制颗粒细胞凋亡,且呈现出剂量依赖性；而雌激素受体抑制剂ICI182780能够阻断这一效应。2.采用流式细胞仪分析了E2对水牛颗粒细胞细胞周期的影响。结果显示,单独添加10-5mol/L E2处理颗粒细胞后,G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例显著增加,ICI182780单独处理和E2+ICI182780联合处理的样品细胞周期均没有显著变化。3.利用qRT-PCR技术分析了E2对水牛颗粒细胞凋亡相关基因和miRNA表达的影响。结果显示,ERβ和Fas等凋亡相关基因及miRNA在不同处理组中均有表达,E2处理后,ERβ和Bcl-2基因表达水平提高,Fas等基因和miR21-5p等miRNA表达降低,其他处理组相关基因和miRNA表达无显著变化。4.采用western-blot方法检测了E2对水牛颗粒细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果显示,E2处理后Fas、Bax、caspase9蛋白表达量降低,其蛋白质水平分析结果与mRNA水平表达情况一致。其他处理组3个蛋白的表达均无显著变化。以上结果表明,水牛卵泡闭锁过程中有大量颗粒细胞发生凋亡,且随着卵泡闭锁程度加深凋亡率升高。Fas、Bcl-2和ATF4等死亡受体、线粒体和内质网三条凋亡信号通路的相关基因和]miRNA21-5P等部分miRNA均参与了水牛颗粒细胞凋亡的表达调控。E2通过剂量依赖方式有效抑制体外培养的颗粒细胞发生凋亡,同时通过其受体ERβ的介导影响细胞周期、部分凋亡相关基因及miRNA表达的方式来促进颗粒细胞增殖。