论文部分内容阅读
目的:
建立牛胚胎干细胞的获取、分离、培养体系,摸索牛ESCs的培养条件。为核移植的优选供体细胞,用于提高牛的克隆和牛乳腺生物反应器研究的效率。
方法:
本试验分为两部分:一,饲养层的制备。饲养层包括牛骨髓充质干细胞饲养层、牛乳腺干细胞饲养层和牛成纤维细胞饲养层。牛MSCs饲养层的制备采用:从屠宰场得到新鲜牛股骨,用注射器抽取骨髓间充质干细胞,过滤离心,培养传代,取第3代生长旺盛的牛MSCs,采用丝裂霉素C处理,然后用磷酸缓冲液清洗后用做饲养层。牛MaSCs饲养层的制备采用:从屠宰场得到新鲜荷斯坦奶牛乳腺,酒精消毒,PBS清洗,剪成小块,消化离心,接种培养,传代,取第3代牛MaSCs用做饲养层。牛SFCs饲养层的制备采用:组织块培养法培养黑牛上皮组织和肉牛肌肉组织,采用第3代的牛SFCs做饲养层。二,牛胚胎干细胞的获得分离培养及鉴定。牛胚胎干细胞的获得采用:选取健壮、发情周期正常、2-3胎母牛做实验牛,待发情后用FSH减量注射法激素处理母牛,人工授精,冲胚得到胚胎,将胚胎移至制备好的饲养层培养皿中孵化培养,囊胚ICM细胞数量增殖4-6d后,得到生长集中、隆起明显的ICM集落,即牛胚胎干细胞。牛胚胎干细胞分离培养及鉴定:在体视镜下,用自制的口吸管连接玻璃微针小心挑起ICM,使之与饲养层以及滋养层细胞分离,对牛胚胎干细胞进行传代培养,并进行形态学、染色、核型分析等鉴定。
在试验中选用了三种不同的细胞(牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛乳腺干细胞)作饲养层来进行分离培养牛ES细胞,比较了其培养效果。选取三种胰酶+EDTA组合(0.25%胰酶-0.04%EDTA、0.20%胰酶-0.04%EDTA和0.02%胰酶-0.04%EDTA)消化处理牛ES细胞,比较其消化效果。对胚胎进行冷冻解冻三种不同处理(鲜胚、冻存解冻1次、冻存解冻2次),观察牛ESCs生长状况。
结果:
1.证明牛ESCs和饲养层有着很大的关系,用牛MSCs做饲养层培养的牛ESCs要比用牛MaSCs和FSCs做饲养层试验研究效果好;
2.用较低浓度的消化液(0.02%胰酶-0.04%EDTA)消化得到的ESCs克隆率最高,所传代数最高,效果较好;
3.冷冻与解冻处理不会对牛ESCs产生损害性的影响,牛ESCs具有一定的抗外界环境的能力。
4.相近的集落,通过相互吸引,具有自发形成典型的ES集落的能力。
5.通过形态学观察,核型分析,及AKP染色鉴定符合牛ESCs特征。