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目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经系统退行性疾病,而AD的一个明显病理特征是β样淀粉多肽(amyloidβ,Aβ)在神经组织的沉积。Aβ来源于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的异常裂解。CCAAT-增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer binding proteinsβ,c/EBPβ)是转录因子c/EBPs家族的重要成员,对基因的表达调控起着重要的作用。本研究旨在探讨转录因子c/EBPβ对APP基因启动子转录活性的影响及其对APP基因表达调控的作用机制,进一步探讨c/EBPβ在AD发病过程中的作用,为AD的预防和治疗提供新的思路。方法1.载体构建:利用分子克隆技术,构建pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒载体和pCDNA3.1-Sp1真核表达载体。2.萤火虫荧光素酶报告基因检测实验(Luciferase assay):将c/EBPβ真核表达载体pCDNA3-c/EBPβ与萤火虫荧光素酶报告质粒pGL3APP170/147共转染到U87MG细胞中,用Renilla作为内参,通过对萤火虫荧光素酶活性的分析,确定c/EBPβ蛋白对APP基因启动子活性的影响。3.实时定量荧光PCR(Real Time PCR,RT-PCR):用Trizol法提取用c/EBPβ慢病毒和用作对照的空载体病毒感染的HT22细胞的总RNA,进行反转录,然后再合成cDNA后进行real-time PCR,检测c/EBPβ、APP和Sp1基因在转录水平上的表达。4.蛋白免疫印迹实验(Western blotting):提取用c/EBPβ慢病毒和用作对照的空载体病毒感染的HT22细胞的总蛋白,进行常规蛋白免疫印渍实验,检测c/EBPβ、APP、Sp1及P65蛋白在翻译水平上的表达。5.免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,Co-IP):将真核表达载体c/EBPβ和P300共同转染到HT22细胞中,48小时后收获细胞总蛋白,进行免疫共沉淀,确定c/EBPβ蛋白和P300蛋白之间是否有直接的相互作用(physical interaction)。结果1.载体构建结果:pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒载体和pCDNA3.1-SP1真核表达载体经酶切鉴定和测序后,证实所克隆序列及相位完全正确。2.Luciferase assay实验结果:c/EBPβ蛋白可上调APP基因启动子(-170到+147)的活性。3.RT-PCR结果:c/EBPβ过表达组的c/EBPβ、APP和Sp1的RNA表达水平均高于空载对照组的。4.Western blotting实验结果:c/EBPβ过表达组的c/EBPβ、APP、Sp1和P65的蛋白表达水平均高于空载对照组的。5.Co-IP实验结果:c/EBPβ蛋白和P300蛋白之间有直接的相互作用。结论c/EBPβ对APP基因在转录和翻译水平具有上调作用。其作用机制可能有:1.c/EBPβ作为一个转录因子,可以调控基因的表达,它对APP基因表达调控的作用机制可能在于其能促进内源性Sp1基因的表达,而Sp1则是APP基因表达的上调因子,它可与启动子近端GC盒的结合,促进了APP基因的转录和表达,c/EBPβ和Sp1在基因表达调控方面有着协同作用。2.c/EBPβ过表达也能引起细胞内P65的表达水平显著增加,于是,我们推测c/EBPβ极有可能激活NF-κB通路从而影响下游因子,实现对APP基因表达的调控作用。3.c/EBPβ蛋白和P300蛋白之间存在着相互作用,我们推测c/EBPβ蛋白和P300蛋白可形成转录复合物,从而实现对APP基因表达的调控作用。