坏死杆菌是一种宿主广泛的致病菌,可引起多种动物以及人类的化脓性、坏死性感染,对我国养牛业具有重要的经济意义。病原体对宿主细胞的黏附是细菌感染的初始和关键之一,这对细菌在细胞外定植和内化具有重要作用。革兰氏阴性菌外膜蛋白在细胞黏附过程中具有重要作用,因此本试验目的是原核表达重组43 kDa OMP并评价其对宿主细胞的黏附作用。在本试验中,根据本实验室前期发表在GenBank的坏死杆菌43 kDa OMP氨基酸序列,针对大肠杆菌具有偏嗜性的密码子进行优化,人工合成43 kDa OMP基因。将该基因连接至pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌中表达。将成功表达的重组蛋白进行纯化,应用牛坏死杆菌H05菌株的天然血清经Western bolt方法分析其抗原性,免疫家兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA方法测定抗体效价,然后利用Western blot方法鉴定制备的重组43 kDa OMP兔多克隆抗体是否能识别坏死杆菌天然43 kDa OMP。培养BHK细胞、牛子宫内膜细胞和原代牛乳腺上皮细胞,利用间接免疫荧光方法,评价43 kDa OMP对细胞的黏附作用。在黏附抑制试验中,重组43 kDa OMP兔多克隆抗体与坏死杆菌A25菌株共孵育后,分别加入细胞培养孔中,在细胞培养箱中,37℃条件下作用1 h,通过细菌革兰氏染色方法,评价重组43 kDa OMP兔多克隆抗体对细菌黏附细胞的抑制作用。本试验成功表达并纯化了重组43 kDa OMP,且其具有较好的反应原性,制备的重组43 kDa OMP兔多克隆抗体效价为1:6 400,能识别坏死杆菌天然的43 kDa OMP;坏死杆菌43 kDa OMP与BHK细胞、子宫内膜细胞和原代牛乳腺上皮细胞孵育后,细胞表面出现绿色荧光,而对照组未见到荧光;重组43 kDa OMP兔多克隆抗体阻断组的坏死杆菌黏附数量减少。本试验证实了坏死杆菌重组43 kDa OMP具有黏附功能,且能黏附于BHK细胞及宿主细胞即牛子宫内膜细胞和原代牛乳腺上皮细胞,为坏死杆菌的感染机制研究提供理论基础。