高效液相色谱作为生物大分子分离纯化的重要方法,近年来在蛋白折叠方面也显示出其独特的魅力,并且已经发展成为蛋白折叠液相色谱法,对很多重组蛋白药物实现了成功复性。蛋白折叠液相色谱法的特点是蛋白折叠是在固定相表面进行的,因此固定相的性质对蛋白的折叠起到了很大作用。本实验室近期合成的具有离子交换和疏水两种机理的二维色谱填料,仅用一根色谱柱,就可以实现HIC-IEC或IEC-HIC的二维色谱分离效果,这种新型色谱填料已经在蛋白分离上取得了很好的效果。本论文以还原变性的核糖核酸酶A为模型蛋白,对这种双功能色谱固定相在蛋白复性方面应用的可行性和优越性进行了探讨。此外,应用三种多维色谱-质谱联用模式对新生儿脐带血血清中活性成分进行了初步筛选。本论文共四章第一章：文献综述概括介绍了蛋白折叠液相色谱法的发展、进展及应用,本论文的研究策略和意义,以及多维色谱在蛋白质组学中的应用。第二章：采用双能功色谱固定相,在离子交换色谱（IEC）模式下,详细考察了流动相中脲浓度、pH、流速、蛋白浓度、还原型谷胱甘肽／氧化型谷胱甘肽（GSH／GSSG）对还原变性核糖核酸酶A的折叠影响。发现在复性流动相中加入低浓度的脲能够有效抑制还原变性RNase A的聚集沉淀,而GSH／GSSG的加入能够加速二硫键的对接反应,并且在较高的流速下复性可以取得更好的结果,在对各因素进行条件优化后,得到一个最佳条件,在该条件下,还原变性RNase A的质量回收率为85.5%,活性回收率为75.0%。在IEC模式下,蛋白的质量回收率较高,并且可在高变性蛋白浓度下进行复性。第三章：采用双功能色谱固定相,在疏水色谱（HIC）模式下,详细讨论了流动相中添加不同浓度的脲、不同比例的GSH／GSSG、流动相pH和变性蛋白浓度对还原变性RNase A折叠效率的影响。结果表明,流动相中添加2.0 mol／L的脲,不仅可以有效抑制变性蛋白的聚集沉淀,还可提高其复性效率和质量回收率。弱碱性的流动相和一定比例的GSH／GSSG有利于还原变性RNase A二硫键的正确对接。在最优化复性条件下,HIC对还原变性RNase A能完全复性,还原脲变RNase A的活性回收率和质量回收率分别为98.0%和61.9%,而还原胍变分别为100.1%和66.8%。在疏水模式下,蛋白的活性回收率较高。第四章：使用多维色谱（mDLC）结合基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对新生儿脐带血血清中抗肿瘤活性成分进行了筛选和制备。首先用分析型的SEC对脐带血进行了预分离,活性检测后,对有活性的组分进行了进一步分离纯化。采用排阻-反相,排阻-疏水-反相,排阻-高效排阻-反相三条路线分别对脐带血血清进行了分离纯化。最终确定这种活性成分的分子量为7756Da。