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柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)是一种具有经济重要性的病害,广泛分布于世界各柑桔产区,对世界柑桔产业造成了严重威胁。CTV主要通过嫁接和蚜虫传播流行,褐色桔蚜(Toxoptera citricida)是强力媒介昆虫。CTV属于长线形病毒(Closterovirus),基因组为19,296个核苷酸组成的正义单链RNA,是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒,具有12个开放阅读区(ORF1a、ORF1b、ORF2～ORF11),其中ORF7和ORF6编码主要衣壳蛋白p25和次要衣壳蛋白p27,ORF10编码疏水性蛋白p20。这三个蛋白有可能在褐色桔蚜传播CTV中发挥重要作用,并且p25被认为与CTV致病性有关,为了更多了解这三个基因及其蛋白的信息,本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT- PCR)扩增,克隆上述三个基因全长,应用生物信息软件和生物信息网站分析其碱基组成,建立其系统进化树,预测其蛋白的等电点、二级结构和跨膜区,为进一步进行基因原核表达蛋白,制备CTV编码蛋白特异性抗体,深入进行桔蚜传播CTV及其致病机理研究提供了基础数据。1.构建了三个基因的克隆载体CTV-p25、CTV-p27和CTV-p20以带有CT11的核酸粗提物为模板,经RT-PCR扩增获得p25、p27、p20全长ORF,PCR产物经回收纯化后连接到克隆载pTA-2上,转化E.coli菌株DH5a,利用氨苄青霉素抗性及a-互补筛选阳性菌落进行菌落PCR和EcoR I酶切鉴定,获得到三种重组质粒,分别命名为CTV-p25、CTV- p27和CTV-p20。2.基因序列碱基组成分析用DNAStar软件对三个基因序列碱基组成进行分析,编码两个外壳蛋白的p25和p27分别有672nt和723nt,碱基出现频率均为A最高,其含量分别为28.87%和31.12%,碱基C最低,分别为18.60%和17.98%。p20全长有549nt,按照碱基出现频率从高到低依次为T(160个)、G(139)、A( 136个)、C(114个),其含量分别为29.14%、25.23 %、24.77 %和20.77%3.聚类分析与GenBank收录的9个已测全基因序列的CTV分离株的相同的三个基因进行核酸和氨基酸聚类分析,核酸聚类分析中CT11的p25与VT、NuagA、SY568、T318A的聚类在一个大分支上,CT11的p27与西班牙强毒株T318A的聚类在一个分枝上,CT11的p20与T318A、NuagA的聚在一个小分支上。氨基酸进化聚类分析表明CT11的p25与SY568的聚类在一个分支上,p27和p20的氨基酸进化树与其核酸进化树反映的各分离株之间的亲缘关系基本相同。4.三个蛋白氨基酸组成和等电点预测p25编码223个氨基酸,其中强碱性氨基酸有31个,强酸性氨基酸有30个,疏水氨基酸73个,极性氨基酸61个。p25等电点为7.831,pH 7.0时带有1.329个正电荷。p27编码241个氨基酸,其中35个强碱性氨基酸,34个强酸性氨基酸,74个疏水氨基酸,63个极性氨基酸。p27等电点为7.753,pH7.0时带有1.475个负电荷。p20编码182个氨基酸。其中强碱性氨基酸有21个,强酸性氨基酸有22个,疏水氨基酸68个,极性氨基酸45个。p20等电点为6.979,pH 7.0时带有0.061个负电荷。5.三个蛋白二级结构预测p25和p27两个外壳蛋白的二级结构以无规则卷曲为主。p20的二级结构以α螺旋为主。6.三个蛋白的跨膜区分析p25氨基酸序列的170-191位可能形成一个从里到外的跨膜螺旋结构、170-194可能形成一个从外到里的跨膜螺旋结构;p27氨基酸序列的17-33位之间可能形成跨膜的螺旋;p20蛋白氨基酸序列可能形成3个从里到外的跨膜区,氨基酸序列分别为96- 117、154-170、163-182,一个从外到里的螺旋,氨基酸序列为96-116位。