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粘虫Mythimna separata(Walker)隶属于昆虫纲(Insecta),鳞翅目(Lepidoptera),夜蛾科(Noctuidae),为季节迁飞性害虫。粘虫是一种完全变态类型的昆虫,它的一生总共需要经过四个阶段:卵、幼虫、蛹和成虫。幼虫共6个龄期,从5龄开始进入暴食期,期间主要取食小麦、玉米、水稻等禾本科作物,是严重威胁我国粮食生产的重大生物害虫。幼虫的饲养密度可以影响到幼虫的取食行为和成虫的迁飞特性。相对于低密度(1头/瓶)而言,高密度(10头/瓶)的粘虫幼虫取食更积极,取食量更大。而且高密度(10头/瓶)条件下的粘虫幼虫,其发育成的成虫具有迁飞特性。PKG是cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP dependent protein kinase,PKG),属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,在真核生物界分布很广。已有研究资料表明,PKG基因可调节动物取食行为,可以作为粘虫觅食行为的候选基因。因此,利用候选基因法,探讨PKG对两种生活型(1头/瓶和10头/瓶)粘虫幼虫取食行为的影响,旨在为粘虫迁飞分子机制的相关研究提供一些数据。首先,我们对不同生活型粘虫5龄幼虫脑中PKG蛋白的活性及其蛋白表达量进行了测定。然后运用RNA干扰技术和药理学手段对对PKG基因进行功能验证,检测10头/瓶的粘虫幼虫的取食量的变化。研究结果如下:1.设置了6组不同的幼虫饲养密度(1头/瓶、5头/瓶、10头/瓶、15头/瓶、20头/瓶和30头/瓶),检测这6种生活型粘虫5L幼虫脑中PKG蛋白的活性。结果显示1头/瓶的粘虫幼虫脑中PKG蛋白活性最高,10头/瓶和15头/瓶的粘虫幼虫脑中PKG蛋白的活性显著低于1头/瓶,而且10头/瓶和15头/瓶的差异不显著。2.运用western blot技术检测两种生活型粘虫幼虫脑中PKG蛋白的表达量,结果没有得到PKG蛋白的电泳条带。3.采用RNAi技术干扰PKG基因,设计了4个dsRNA进行干扰,结果只有片段2的dsRNA在提高注射量的情况下干扰有效,使得PKG基因的表达量降低,但是降低不显著。4.用浓度为1000?M的8-Br-cGMP(cGMP激动剂)的饲料饲养粘虫幼虫,结果发现幼虫取食量显著降低,PKA蛋白活性和PKG蛋白活性都显著升高。而用浓度为1000?M的8-Br-cAMP(cAMP激动剂)的饲料饲养粘虫幼虫,粘虫幼虫取食量降低但不显著,PKA蛋白活性显著升高,PKG蛋白活性变化不显著。本实验首先通过对6组不同的饲养密度下粘虫幼虫脑中PKG蛋白活性进行测定分析,发现1头/瓶和10头/瓶的PKG蛋白活性差异显著,而且前人研究发现10头/瓶的粘虫成虫迁飞能力最强,因此确定了1头/瓶和10头/瓶这两种生活型的粘虫作为研究对象。然后运用western blot技术对两种生活型粘虫幼虫脑中PKG蛋白进行定量分析,还通过RNA干扰技术尝试了对PKG基因的干扰,虽然western blot和RNAi结果都不理想,但也可以为我们的后续实验提供了一些建议:在进行western blot实验之前,要确保所提蛋白质量较好;在RNA干扰过程中,继续加大片段2的dsRNA的注射量应该可以成功干扰PKG基因,使PKG基因的表达量显著降低。最后通过药理学手段处理粘虫幼虫,结果发现分别用cGMP激动剂和cAMP激动剂处理过的饲料饲养粘虫幼虫,幼虫取食量均降低,而且用cGMP激动剂处理过的饲料饲养的粘虫幼虫取食量显著降低,这说明PKG基因可能参与了粘虫幼虫的取食行为的调节。这些结果有利于粘虫幼虫取食行为分子机制研究的进一步进行。