新型纳米材料基电化学DNA传感器的构建及其在KRAS基因检测中的研究

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与癌症相关基因的分析检测对肿瘤早期筛查及治疗过程的动态监测具有非常重要的意义。鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)突变状态是人非小细胞肺癌、结直肠癌等多种癌症所关注的研究热点之一,在癌症的靶向药物筛选研究中也发挥着关键作用,所以KRAS基因突变状态的检测至关重要。随着纳米技术与多学科领域的不断交叉渗透,基于生化传感的检测方法为体外诊断疾病标志物提供了新的思路。电化学检测方法的简便易行及高灵敏度使其在分子检测上具有很好的优势,本论文构建了一系列可用于KRAS基因检测的高灵敏电化学DNA生物传感器,为新型电化学DNA传感器的研究提供了新的思路和方法。主要研究工作如下:(1)构建了基于MoS2/MWCNTs-COOH的高灵敏电化学DNA传感器用于KRAS基因检测制备了MoS2/MWCNTs-COOH复合纳米材料并修饰到玻碳电极表面,将5’端氨基修饰的捕获探针分子通过酰胺共价键固定到MoS2/MWCNTs-COOH工作电极表面,并以亚甲基蓝做电活性指示剂,实现了对KRAS基因的人工合成序列的灵敏检测。实验采用SEM、HR-TEM、FTIR、XRD和XPS对MoS2/MWCNTs-COOH材料进行了表征,并通过CV和DPV等电化学方法对传感器的构建过程和电化学性能进行了表征和测试。研究结果表明,复合材料中MWCNTs-COOH缠绕穿插在片状MoS2之间,为电极表面探针的固定提供了大的比表面积,提高了传感器的检测性能,该传感器对KRAS基因人工合成序列的检测线性范围为1.0×10-141.0×10-77 M,其检测限达到了3 fM,且表现出了良好的选择性、稳定性和重复性,血清加标实验结果良好,说明此传感器在基因突变检测中具有良好的实际应用价值。(2)构建了基于催化发夹自组装(CHA)的电化学DNA传感器用于KRAS基因检测采用电沉积的方法在玻碳电极表面修饰纳米金,然后通过Au-S键将捕获探针固定在电极表面,并引入了CHA信号放大策略进一步提高传感器的灵敏度。实验采用SEM对纳米金进行了表征,并通过CV和SWV等电化学方法对电极修饰过程和传感器检测性能进行了研究。结果表明,所构建的电化学DNA传感器对KRAS基因人工合成序列的最低检出限为0.06 fM,检测线性范围为0.5×10-151.0×10-8M,且具有良好的特异性,稳定性和重复性,血清加标实验结果良好,说明此传感器在基因突变检测应用方面具有一定的潜在价值。(3)构建了基于粘性末端介导链置换(TSDR)和Au/MoS2/rGO的电化学DNA传感器用于KRAS基因双突变位点的同时检测采用水热法合成了MoS2/rGO,并在MoS2/rGO上原位生长AuNPs,离心冻干后得到Au/MoS2/rGO复合纳米材料,将材料修饰到玻碳电极上,并通过Au-S键将信号双链固定在电极上以实现检测过程。实验通过SEM、XRD等对所合成的电极修饰材料进行了表征,同时也通过CV、SWV等电化学方法对传感器的修饰过程以及电化学的检测性能进行了研究。结果表明,所构建的电化学DNA传感器可以实现对KRAS基因c.35G>A,c.34G>T两种突变位点的检测,检出限分别为10.20fM和17.16 fM,线性范围均为1.0×10-131.0×10-7 M,并且获得了较好的选择性,重复性和稳定性,血清加标实验结果良好,说明此传感器在多位点基因突变检测应用方面具有一定的潜在价值。
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