本实验室从紫茎泽兰上成功分离了其天然致病菌——链格孢菌（Alternaria alternata（Fr.）Keissler）,具有开发成为生物除草剂的潜力。进一步研究发现,链格孢菌产生的毒素TeA具有较强的除草活性,其杀草机理是与光系统Ⅱ的D1蛋白结合,抑制叶绿体类囊体膜上光系统Ⅱ受体侧QA到QB之间光合电子的传递,引起光合放氧速率和表观量子效率降低,导致过能量化,引起叶绿体内活性氧迅速爆发,叶绿体破裂,活性氧弥散,造成细胞死亡。但是,由于链格孢菌代谢产生TeA毒素的量很低,利用生物发酵生产较困难,没有商业化前景。通过研究明确与毒素合成相关的代谢通路及调控机制可以用于链格孢菌的基因改造以提高毒素产量,从而为将该菌开发作为生物除草剂打下理论基础。我们前期已通过限制性内切酶介导整合法（REMI）获得了无致病力的链格孢菌突变体。后利用锚定PCR的方法克隆了敲除的基因为组氨酸磷酸酶家族HP001基因。本文主要对链格孢菌毒素TeA在病原菌侵染寄主过程中的地位进行研究,同时对HPO01基因在链格孢菌生长发育及致病过程中的功能和地位进行了系统的分析,研究结果如下:1.TeA毒素是链格孢菌致病的毒力因子利用链格孢菌野生型和突变体作为材料,探索TeA毒素在链格孢菌致病过程中起到的作用。结果发现,在野生型链格孢菌菌丝侵入寄主组织前便已经检测到了寄主的伤害,寄主的PSⅡ反应中心被阻断,抑制跨膜质子梯度的形成,过量的光能对植物的光合系统造成损伤。而原本不会引起病斑的突变体菌丝在添加了野生型培养滤液或一定浓度的TeA后也可以对寄主产生伤害,且其菌球形态可以恢复到野生型的状态,体内过氧化物酶活性升高,ROS含量显著下降,且在寄主表面可以产生附着胞,恢复部分侵染能力。同时发现,突变体也可以使破损表皮的寄主叶片产生病斑,且其在破损叶片上体内ROS含量也有所下降。说明毒素可以恢复突变体的致病能力。以上结果说明,链格孢菌TeA毒素产量下降是导致突变体丧失对寄主侵染力和致病力的重要原因;TeA毒素在链格孢菌体内ROS平衡的维持、产生附着胞突破寄主表皮屏障完成侵染过程等方面起着重要作用,是链格孢菌侵染致病过程中的关键毒力因子。2.HPO01是链格孢菌致病过程中的基因毒力因子为了研究HP001基因的功能,利用抑制性消减杂交技术（SSH）,以野生型菌株为检测样本,突变体菌株为对照样本,从构建的正向杂交库中挑选了 1210个单菌落,挑选其中有插入单片段的845个样品进行杂交验证,筛选到了 73个差异显著的杂交斑点。进一步对这73个差异显著的斑点进行测序,将获得的EST通过NCBI对比分类,同时将这些基因通过 COGEME Phytopathogenic Fungi and Oomycete EST database数据库进行基因功能分析,结果发现除了核糖体蛋白和未知基因外,大多数基因都和真菌的生长、致病和代谢相关,形成了广泛的代谢网络。这些筛选到的基因为HP001基因调控的下游基因,同时也是与链格孢菌产毒代谢相关的基因。为了进一步验证这些差异基因的准确性,利用荧光定量PCR技术（Real-time PCR）对其中12个基因检验了其在野生型和突变体体内基因表达量的差异。结果发现,9个基因在野生型菌株和突变体体内的表达存在显著差异,阳性率约为75%。这9个基因中,存在已有研究报道的与真菌致病相关的乙二醛氧化酶、磷酸转酮酶和磷酸甘油酸激酶等。此外,通过序列分析比对,还发现筛选到的差异基因中,含有促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）基因。而G蛋白信号途径可作为MAPK信号传导途径的上游参与调控该途径的激活,且有研究表明G蛋白β亚基可以作为组氨酸磷酸酶的底物。为了验证HP001和Gβ的关系,采用酵母双杂交的方法检测它们是否存在互作,结果显示同时转化了 HP001和Gβ的酵母可在含有X-α-gal和Aureobasidin A的四缺平板SD-Trp-Leu-Ade-His上显蓝色的,说明两者可在酵母体内互作。同时,采用体外His pull down的方法进行验证,结果发现两个蛋白可同时被50mM的咪唑缓冲液从Ni2+柱上洗脱下来,由于HP001含有His-tag而Gβ无His-tag,这就证明了两者在体外是互作的。这些结果显示,HP001参与了 G蛋白信号途径。为了进一步验证HP001在链格孢菌致病过程中的作用,通过真菌原生质体转化的方法,得到HP001的回补菌株。同时,克隆了 MAPK信号传导途径中Ste11、Ste7、Fus3和Ste12基因,并通过荧光定量PCR测定了Gβ及上述基因的基因表达量,结果发现,无论在病原真菌生长还是侵染阶段,突变体体内的该条信号途径的基因表达量均低于野生型,而回补菌株体内表达量较突变体有所提高,且发现该条途径所有基因的表达量存在时间次序性,说明HP001参与调控了该条信号传导途径。对链格孢菌野生型、突变体和回补菌株的生理学功能分析发现,HP001的缺失导致真菌气生菌丝的生长受限,孢子形态产生变化且严重影响孢子产量。三个菌株的孢子均可在寄主表面正常萌发,但是突变体无法侵染寄主。突变体的致病力显著下降,回补菌株则能部分恢复致病性。突变体细胞壁厚度仅为野生型的一半,菌丝对于溶壁酶的敏感性增加,而对盐胁迫却表现出不敏感。突变体体内黑色素的含量也明显低于野生型。同时,突变体体内的活性氧含量较野生型明显偏高,胞外过氧化物酶酶活也较低。这些结果表明HP001作为链格孢菌一个致病因子参与调控了真菌生长、侵染、致病等各个生理功能。综上所述,TeA和HP001是链格孢菌侵染致病过程中的毒力因子。前者是毒素,其在链格孢菌体内产生可能受到HP001基因调控,但是是决定链格孢菌致病力的直接毒力因子,外源TeA可以部分恢复HP001的缺失突变体的致病力,因此,两者相辅相成,共同调控链格孢菌的侵染致病过程。