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Na,Mg,K,Ca,Mn,Fe,Zn,Ni,Cu,Co和Mo等生物金属对于生物体的生存和生长是至关重要的,可参与多种生理代谢活动。铁作为一种必需元素,几乎被所有的病原菌和它们的哺乳动物宿主所需求,铁可作为众多细胞蛋白的辅助因子参与多种过程,包括DNA合成和修复、细胞呼吸、生物降解和生物合成途径以及转录调控。病原体想要成功感染宿主,就必须获得铁。然而,在有压力的宿主环境中,由于宿主体内的某些蛋白质的铁螯合活性,导致细菌病原体不易从宿主体内获得铁。因此病原菌会采用许多策略获取铁。最新研究表明铜绿假单胞菌中的喹诺酮信号分子PQS可以介导铁的摄取,即由第三套VI型分泌系统（H3-T6SS）分泌的TseF蛋白可以与外膜囊泡（OMV）上的PQS-Fe3+结合形成TseF-OMV-PQS-Fe3+复合物,然后TseF蛋白作为纽带使得TseF-OMV-PQS-Fe3+复合物与受体Fpt A或Opr F识别,并将PQS-Fe3+运输至周质空间。但是PQS-Fe3+复合物是如何穿过内膜的尚不清楚。针对该问题,本研究通过生长曲线分析、胞内金属离子和PQS含量分析、分析动力来源缺失对PQS-Fe3+转运的影响、分析内膜转运蛋白对PQS信号的影响和内膜转运蛋白之间及与其相关蛋白之间互作关系的研究等手段,对涉及铜绿假单胞菌PQS介导的铁离子摄取的分子机制的内膜蛋白进行了鉴定及其功能研究。结果如下:1.首先通过在限铁的培养条件下的生长曲线分析和细菌双杂交库筛选等方法,本研究鉴定了3个铜绿假单胞菌PQS-Fe3+的内膜转运蛋白或蛋白复合体（FptX、PchHI和FepBCDG）。并且发现这三个内膜转运蛋白或蛋白复合体（Fpt X、Pch HI和FepBCDG）也是介导Pyochelin穿过内膜的转运蛋白,即这些内膜转运蛋白同时负责铜绿假单胞菌PQS-Fe3+和Pyochelin-Fe3+向胞内的转运,并且铜绿假单胞菌在摄取PQS-Fe3+和Pyochelin-Fe3+时似乎主要依赖于Fpt X。2.通过体外共培养方法,验证了Fpt X、Pch HI和FepBCDG等内膜转运蛋白或蛋白复合体对于铜绿假单胞菌摄取利用PQS-Fe3+或Pyochelin-Fe3+等复合物具有一定的重要性,即缺失Fpt X、Pch HI和FepBCDG等内膜转运蛋白或蛋白复合体将会降低铜绿假单胞菌对PQS-Fe3+或Pyochelin-Fe3+等复合物的摄取利用能力。通过使用ICP-MS测定胞内金属离子浓度等实验表明Fpt X、Pch HI和FepBCDG等内膜转运蛋白或蛋白复合体只允许铁离子或铁离子复合物通过,而对于锰离子和锌离子则是通过其它转运蛋白运输。接下来通过质子载体碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）抑制细胞的质子动力势以及定点突变ATPase结构域Walker B motif上的保守氨基酸残基等试验验证了当动力源缺失后,铜绿假单胞菌不能有效地摄取利用PQS-Fe3+或Pyochelin-Fe3+等复合物。而且,虽然Pch H和Pch I均具有ATPase结构域,但是Pch HI转运蛋白复合体的能量来源于Pch H的ATP酶活性。3.通过启动子转录融合试验说明了在限铁培养条件下,PQS主要以PQS-Fe3+的形式进入细胞,且这个过程依赖于Fpt X、Pch HI和FepBCDG等三个内膜转运蛋白或蛋白复合体。同时,Pyochelin生物合成操纵子的调控也依赖于Fpt X、Pch HI和FepBCDG等三个内膜转运蛋白或蛋白复合体。并且在大蜡螟感染模型中,Fpt X、Pch HI和FepBCDG等三个内膜转运蛋白或蛋白复合体均在铜绿假单胞菌的毒力方面发挥重要作用。4.最后通过细菌双杂交试验证明了Fpt X与FepB、FepD和FepG之间存在互作,且FepB、FepC、FepD和FepG内部之间存在互作,Pch H和Pch I之间存在互作,但与其它蛋白之间没有相互关系。然而通过三杂交试验证明Pch H和Pch I形成的二聚体Pch HI与Fpt X、FepB、FepC、FepD和FepG之间存在互作。表明这三个内膜转运蛋白或蛋白复合体之间可以相互结合在一起形成更大的蛋白复合体向胞内运输PQS-Fe3+或Pyochelin-Fe3+等复合物。综合上述的研究结果,我们提出了铜绿假单胞菌共转运PQS-Fe3+和Pyochelin-Fe3+穿过内膜进入胞内的分子机制模型,即胞外的PQS-Fe3+通过外膜囊泡（OMV）运输,在VI型分泌系统效应蛋白TseF的介导下,OMV上的PQS-Fe3+通过外膜受体Opr F和Fpt A进入周质空间,同样,胞外的Pyochelin-Fe3+也通过外膜受体Fpt A进入周质空间。然后,在Fpt X、Pch HI和FepBCDG等三个内膜转运蛋白或蛋白复合体的共同介导下,PQS-Fe3+和Pyochelin-Fe3+被转运至细胞质中,接着Fe3+被还原成Fe2+,PQS和Pyochelin游离出来,游离出来的PQS和Pyochelin则分别与PqsR和PchR结合并激活它们的功能,进而分别激活PQS和Pyochelin合成基因簇的表达,以合成更多的PQS和Pyochelin。而从PQS-Fe3+和Pyochelin-Fe3+上被还原并释放出来的Fe2+在胞内积累到一定程度后则与Fur蛋白形成Fur-Fe2+复合体,反过来抑制fpt X、pch HI和fepBCDG等基因的表达。