【摘 要】
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穿梭载体pHY300PLK常作为出发质粒被用于构建表达载体。我们将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温a-淀粉酶基因(amy)表达单元(包括启动子、信号肽及淀粉酶基因)克隆到
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穿梭载体pHY300PLK常作为出发质粒被用于构建表达载体。我们将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温a-淀粉酶基因(amy)表达单元(包括启动子、信号肽及淀粉酶基因)克隆到pHY300PLK中,并用反向PCR、同源重组的方法,去除该重组质粒中的氨苄青霉素抗性基因(Amp),以利用α淀粉酶基因的启动子和信号肽高效表达自身蛋白及外源蛋白。结果表明：连入了α-淀粉酶基因表达单元的pHY300PLK(即pAMY质粒)能够表达α-淀粉酶；且去除了Amp基因的pAMY质粒(即pAMY1质粒)能更有效地表达α-淀粉酶；与pAMY质粒相比,pAMY1质粒对重组菌的生长没有影响,且pAMY1质粒在重组菌中的拷贝数增加了1倍。我们将纤维素酶DL-3基因连接到pAMY1质粒中淀粉酶信号肽的下游,得到的重组质粒pCEL在大肠杆菌中能分泌表达纤维素酶。取发酵上清液进行SDS-PAGE,可见到约55KD蛋白带,这与纤维素酶DL-3分子量相符,测得该酶活性为45U/mL。这表明α-淀粉酶基因的启动子和信号肽不仅能启动自身蛋白的表达,也能启动外源蛋白的表达。此外,我们将蛋白酶K基因与表达载体pAMY1重组后得到了pPRO质粒,并且成功表达了可水解牛奶蛋白的蛋白酶K。在37℃,pH8.0条件下,测到蛋白酶K纯酶液活性为1000U/mL。这是表达载体pAMY1对又一种外源基因的成功表达。当pH为10.0时,蛋白酶K活性最高,这对食品加工行业来说有些偏高,但其在pH6-9和pH11-12之间仍然还有55%以上的活性。以上结果证明pHY300PLK克隆质粒已成功改造成表达质粒,可用于外源基因的分泌表达。
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