灰飞虱唾液腺中与水稻条纹叶枯病毒(RSV)传播相关蛋白的研究

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灰飞虱Laodelphax striatellus(半翅目飞虱科)是亚洲地区水稻上的重要害虫。它不仅刺吸水稻汁液造成危害,更重要的是传播水稻条纹叶枯病毒(Rice sripe virus,RSV)造成水稻条纹叶枯病的流行。RSV是纤细病毒属代表成员,由灰飞虱以循回增殖型方式经卵传播。介体灰飞虱从感染植株吸食获毒后,RSV从肠壁内腔扩散到血淋巴及其它组织,最后到达唾液腺,在介体昆虫取食时又被传至植株。唾液腺是RSV传播需要克服的最后一道屏障,而RSV克服唾液腺屏障的机制缺乏研究。前期的研究发现,带毒灰飞虱唾液腺中α-亚基-ATP合酶(ATP synthase subunit alpha)、微管蛋白-a-2(Tubulin alpha-2)、苹果酸脱氢酶(NADP-dependent malic enzyme)、线粒体内膜移位酶(Mitochondrial import innermembrane translocase)及泛素-60s核糖体L40前体(Ubiquitin-60S ribosomal protein L40precursor)等5个蛋白的表达水平显著高于无毒灰飞虱唾液腺。本论文研究了苹果酸脱氢酶、线粒体内膜移位酶及泛素-60s核糖体L40前体等3个唾液腺差异蛋白的氨基酸全长序列及基因表达,并用RNA干扰研究了α-亚基-ATP合酶、微管蛋白-α-2、线粒体内膜移位酶基因对RSV传播的影响。主要结果如下:  (1)利用克隆与RACE技术,从带RSV的灰飞虱体内成功扩增出2060 bp的苹果酸脱氢酶、661 bp线粒体内膜移位酶及1167bp的泛素-60s核糖体L40前体的的核苷酸全长序列。将全长核苷酸序列提交到NCBI的GenBank数据库中,分别命名为LsNADP、LsMIT及LsUBI。采用实时定量PCR的方法对LsNADP、LsMIT及LsUBI基因表达进行相对定量,结果发现带毒灰飞虱唾液腺和全身中这3个基因的表达均显著上调。与不带毒灰飞相比,带毒灰飞虱唾液腺中LsNADP基因、LsMIT基因及LsUBI的相对表达量分别提高了17.4%、123.6%和62.2%。LsNADP、LsMIT和LsUBI基因在带RSV灰飞虱虫体中的相对表达量较无毒灰飞虱分别提高了25.0%、43.4%和16.7%。  (2)采用RNAi研究了α-亚基-ATP合酶(LsATP)、线粒体内膜移位酶基因(LsMIT)、微管蛋白-α-2(LsTUB)对灰飞虱传播RSV的影响。取食了含dsRNA的人工饲料后,灰飞虱中LsATP、LsMIT、LsTUB的相对表达分别较对照下降了63%、82%、76%,表明RNA干扰效果明显。吸食了dsATP和dsMIT后,灰飞虱的传毒与对照并无差异,未发现这两个基因对灰飞虱传毒有明显影响。取食含dsTUB人工饲料的带毒灰飞虱的传毒率为12%,仅为取食纯人工饲料的对照的30%。表明LsTUB在介体传播RSV中具重要作用。LsTUB协助RSV克服介体唾液腺屏障的机制待进一步详细的研究。
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