【摘 要】
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目的:腺病毒(adenovirus)是一种无包膜双链DNA病毒,分为7个组共55个血清型。该病毒可感染多种器官,从而引起多种疾病。国内外经常有腺病毒感染爆发流行的报道。目前,尚无有效的腺
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目的:腺病毒(adenovirus)是一种无包膜双链DNA病毒,分为7个组共55个血清型。该病毒可感染多种器官,从而引起多种疾病。国内外经常有腺病毒感染爆发流行的报道。目前,尚无有效的腺病毒疫苗投入到普通人群中,且临床上无特定药物治疗腺病毒感染。因此,有效预防、控制及治疗腺病毒感染是亟待解决的问题。六邻体是腺病毒主要的结构蛋白,可以刺激机体产生相应中和抗体。针对腺病毒六邻体抗原性强的区域进行克隆与表达,为研制腺病毒重组基因工程疫苗奠定基础,具有重要的社会意义及经济效益。同时研究药物体外抗腺病毒作用,为研发天然、高效、低毒的抗腺病毒药物提供依据。
方法:应用生物信息学软件,对腺病毒六邻体蛋白的抗原性进行预测,将抗原性预测的结果与六邻体蛋白三维空间结构暴露情况相结合,确定腺病毒六邻体抗原性强的区域,并通过PCR方法对该区域编码基因进行扩增,双酶切后与表达载体pQE31定向克隆,转化到E.coliM15细菌中。经酶切、测序筛选阳性重组体,并进行表达。紫草素体外抗腺病毒的研究中,应用细胞病变抑制试验及MTT方法观察紫草素对腺病毒的抑制作用;应用免疫组化、Western blot及流式细胞术检测紫草素对腺病毒六邻体蛋白表达、HeLa细胞凋亡的影响。
结果:(1)腺病毒六邻体的前段和中段抗原性强,很可能是型特异性表位所在区域;(2)克隆六邻体蛋白L1及L2区,目的基因长度为1426 bp,构建重组质粒pQE31-hexon;(3)重组质粒pQE31-hexon基因序列与Genbank中相应序列同源性为99%;(4)在E.coli M15中表达,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约53KD;(5)MTT结果表明,紫草素能抑制腺病毒复制,其作用模式呈浓度依赖方式;(6)紫草素抑制腺病毒六邻体蛋白的表达;(7)紫草素可以减少由腺病毒感染引起的细胞凋亡。
结论:以上结果表明,阳性克隆重组质粒pQE31-hexon具有腺病毒六邻体蛋白L1、L2区编码基因,从而保证了后续研究样本的正确性,重组工程菌pQE31-hexon/M15的表达,为开发研制预防用抗腺病毒感染的腺病毒基因工程疫苗奠定了基础。紫草素具有抗腺病毒的作用,作用方式是抑制腺病毒的复制,其机制可能与减少细胞凋亡、抑制腺病毒六邻体蛋白表达有关。紫草素具有成为天然、高效、低毒的抗腺病毒药物的潜力。
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