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异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)是目前应用最广泛的荧光素,因其特殊的分子结构及理化性质,FITC常用作荧光标记物对蛋白质、核酸、多糖等生物大分子进行标记。尤其是基于FITC建立的FITC-抗FITC检测系统,能够有效地扩大抗原抗体反应的敏感性。本实验采用直接标记法制备出异硫氰酸荧光素人工完全抗原,并通过杂交瘤技术研制出高亲和力、高特异性的杂交瘤细胞株,利用体内诱生腹水技术制备出抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行了鉴定。抗FITC单克隆抗体的研制为高效、快速地对FITC标记的蛋白质、核酸、多糖等生物大分子进行检测奠定了基础。1.异硫氰酸荧光素人工完全抗原的合成及鉴定采用直接标记的方法将FITC分别与大分子偶联载体牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)进行偶联,合成人工完全抗原FITC-BSA和FITC-OVA。通过紫外吸收光谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和动物免疫法对人工完全抗原的偶联效果进行鉴定。依照紫外吸收光谱结果计算出FITC-BSA和FITC-OVA的偶联比分别为14:1和13:1;SDS-PAGE鉴定结果显示:FITC-BSA和FITC-OVA的条带相对于载体蛋白BSA和OVA的条带出现了明显的拖尾现象,初步证明偶联成功。动物免疫实验结果显示:制备的FITC-BSA能够诱导小鼠产生有效免疫应答,多抗血清效价均可达到1:12800,其中3号小鼠的半数抑制浓度IC50可以达到4.25 ng/mL,表明合成的人工抗原具有良好的免疫原性。2.异硫氰酸荧光素单克隆抗体的制备及鉴定选取免疫效果最好的3号小鼠进行细胞融合,通过间接ELISA法和间接竞争ELISA法筛选出两株强阳性杂交瘤细胞株,分别将其命名为1F11和2A7,采用有限稀释法分别对其进行亚克隆,三轮亚克隆后筛选出细胞培养上清效价较高(1:3200)的2A7杂交瘤细胞株,通过小鼠体内诱生腹水的方法大量制备抗FITC单克隆抗体,通过正辛酸-硫酸铵法对收集到的单抗腹水进行纯化,SDS-PAGE电泳结果显示其仅在53 KD和25 KD处存在两条明显的特异性条带,表明纯度较高。经鉴定,纯化后的2A7单抗效价可以达到1:2.048×106,亲和力常数为1.72×109 L/mol,对FITC的IC50为1.37μg/mL;根据鼠单抗亚型鉴定试剂盒测定其亚型为IgG1、κ轻链型;特异性鉴定结果显示其仅与FITC特异性结合;经过连续三个月的传代培养以及反复冻存、复苏后,2A7杂交瘤细胞株依然能够稳定地分泌抗FITC的单克隆抗体。本研究研制出了高效价、高亲和力的特异性抗FITC单克隆抗体,从而为高效、快速地对各种FITC标记物进行检测打下了基础。