尿路感染是人类最常见的细菌感染之一。它的定义为:病原生物入侵尿路引起的尿路炎症反应。被感染的部位一般包括尿道、膀胱、输尿管、肾脏肾盂等。临床数据表明:高达90%的尿路感染是由尿路致病性大肠杆菌（UropathogenicEscherichia coli,UPEC）引起的。到目前,很多毒力因子被确定在UPEC感染的过程中起到不可或缺的作用。与肠道内共生的和致腹泻的大肠杆菌相比,尿路致病性大肠杆菌的生活环境非常特殊,如尿液对于UPEC来说是营养贫瘠、有胁迫的环境。UPEC如何感应特殊的宿主环境并启动适合的应对机制在当前仍然是一个不太清楚的问题。由于二元调控系统是细菌适应环境的重要机制,本文着重研究UPEC内的二元调控系统,具体内容分为以下三部分:1与尿路致病型相关的KguS/KguR的调控机理研究及其对UPEC致病性的影响二元调控系统（Two-component signaling systems,TCS）,又被称为双组份调控系统,是细菌适应环境的重要机制。因此,二元调控系统对于病原菌适应宿主环境应该起到至关重要的作用。于是,我们通过生物信息学的方法对UPEC的多个菌株的基因组进行分析,预测得到UPEC基因组内所有的TCS,以期待可以发现新的未研究过的TCS系统。结果显示:除了 30个大肠杆菌菌株共有的TCS外,还发现c3564/c3565、c4545/c4546和c5041/c5040为非致病性大肠杆菌菌株中很少存在的。最终,我们选择了c5041/c50 0进行下一步、深入的研究。通过对预测得到的C5041/C5040的三维结构和各结构域的分析,我们在肾盂肾炎分离株UPEC CFT073中鉴定了一个新的二元调控系统 C5041/C5040,并命名为 KguS/KguR（KguS:α-ketoglutarate utilization sensor;KguR:α-ketoglutarate utilization regulator）。通过双重PCR对多种致病型的大肠杆菌的菌种库进行检测发现:kguS/kguR与尿路致病性的大肠杆菌关联紧密,而在非致病性和肠道致病的大肠杆菌中却鲜有发现。利用小鼠尿路感染模型,体内竞争试验显示缺失kguS/kguR造成UPEC在小鼠膀胱和肾脏内定殖显著下降,暗示KguS/KguR具有增加UEPC在体内的适应力的能力。利用比较蛋白组学方法我们找到了 KguS/KguR的多个靶基因,如外膜蛋白（OmpA、OmpW、OmpF）、木糖异构酶XylA、铁结合蛋白SitA以及假定的α-酮戊二酸代谢酶C5035。我们进一步研究发现上调表达KguR可以激活c5035的表达。序列分析发现kguS/kguR和其靶基因c5032到c5039编码在一个基因岛上,而这个基因岛并不存在于肠道致病性大肠杆菌中,暗示这个基因簇很有可能是通过基因水平转移获得的,同时,再次说明其对UPEC的重要性。而且,缺失这个基因岛也会导致UPEC在体内竞争力的下降,说明KguSR影响UPEC的定殖很有可能是由c5032到c5039基因簇介导的。反转录-PCR结果显示上述提到的基因岛编码3个操纵元,分别为:c5032-c5037、c5038-c5039、c5040-c5041。靶基因的表达特异的被α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）所诱导。这些基因与α-KG作为唯一碳源的无氧利用有关。通过凝胶阻滞试验（EMSA）,我们发现KguS/KguR直接正调控c5032到c5039靶基因簇,并参与到α-KG的无氧利用中。最后,进化发育分析表明:kguS/kguR很有可能是通过基因水平转移的方式获得的,而且这个基因位点（loci）具有横向转移的潜力。α-KG是哺乳动物肾脏肾小管细胞中高度积累的物质,用于和有机阴离子进行跨膜交换,进而将它们以尿液的形式排出体外,是肾脏生理功能重要的一部分。所以,上述试验结果暗示了 α-KG的利用对UPEC的重要性,而这个能力促进了 UPEC在肾脏的定殖。综上所述,这一部分内容第一次描述了 一个与UPEC关联紧密的TCS;这个TCS与它的靶基因一起参与在无氧条件下对a-KG利用,进而增加UPEC在体内的适应能力。2 α-酮戊二酸转运蛋白C5038和KgtP在UPEC中的作用α-酮戊二酸广泛存在于宿主细胞,尤其是肾小管细胞中,并且很容易被UPEC利用。这一部分探究了两个转运蛋白C5038和KgtP在利用α-KG上起到的作用、它们的转录调控以及它们对UPEC体内适应性的影响。与UPEC密切相关的c5038很可能是通过基因水平转移获得的,C5038属于DASS（Divalent anion sodium symporter）家族。它与柠檬酸转运蛋白CitT具有49%的氨基酸序列相似性,TMHMM算法预测它含有13个跨膜区域。它含有的SAT序列很可能与α-KG的转运直接相关。kgtP则是相对保守的、广泛存在于致病性和非致病性大肠杆菌中的基因位点,KgtP蛋白属于MFS（Major facilitator superfamily）家族,具有12个跨膜区域。c5038的表达被低氧分压诱导,而kgtP的表达被低氧分压所抑制。无氧条件下,c5038被FNR和ArcA正调控,c5038在α-KG的无氧利用中担当重要角色;而KgtP对于α-KG的有氧利用是必需的,但是它的表达在无氧条件下被FNR和ArcA严重抑制。c5038通过二元调控系统KguSR直接或间接感应低氧分压:kguSR的表达在无氧条件下升高,而低氧分压对c5038的诱导需要kguSR的参与。c5038能被α-KG特异的诱导表达,而kgtP的表达对外界添加的KG没有反应。但是kgtP的表达在M9基本培养基中、以甘油为唯一碳源的时候最高,其次为葡萄糖,最低的是在LB中。与碳源利用有关的CRP蛋白正调控kgtP的表达。此外,我们发现c503和和kgtP的表达受不同的sigma因子控制:分别为σ54（RpoN）和a38（RpoS）。当被相同的组成型启动子驱动时,C5038在无氧环境中效率更高而KgtP在有氧条件时效率更高。在尿路感染的小鼠模型上,当共同感染野生型和c5038突变株或kgtP突变株时,结果显示c5038影响而kgtP并不影响UPEC在体内的适应能力;这种影响是可以被质粒上表达的c5038所恢复的。综上所述,转录水平调控的不同使得C5038和KgtP在KG的利用上发挥的作用不同,进而导致它们在体内的作用不同。所以,这一部分的研究加深了我们对尿路致病性大肠杆菌生理和毒力的理解。3 KguR调控的分子机理初探本部分试图找出KguR在转录水平直接调控的更多靶基因（由于KguR是转录调控因子）,从而对KguR的调控方式作更全面的了解。我们首先对c5038的启动子区域进行了分析,然后利用逐渐缩短启动子并测定启动子活性的方法找到了最短的有活性的启动子Pc5038F3R。接着,在Pc5038F3R区域我们找到了一个反向重复序列TGTGCG-N8-CGCACA。EMSA、启动子-报告基因融合和β-半乳糖苷酶活性测定试验 ·发现反向重复序列区域是被KguR直接结合的,并且极大的影响启动子的活性。但是,缺失反向重复序列区域并没有完全破坏KguR的诱导作用。此外,我们在c5032和kguS的启动子区域也发现了类似的序列,分别为TGTGTG-N13-CGCGCA和TGTGCG-N6-CACACA。缺失相应的区域都大幅的降低了 KguR对DNA探针的结合。KguR可以自调控kguSR操纵元,这种自调控很可能依赖于结合到上述的位点上。而且,这些结合位点在大肠杆菌中都非常保守。所以,我们利用这些序列生成了结合的通用序列,进一步利用生物信息学的方法,在CFT073的基因组内进行搜索、匹配。结果显示,有20个位点被筛选出来;有的在基因的编码区,有的在基因间区,即可能为启动子区。总之,本文系统性的阐述了二元调控系统KguSR的鉴定,通过揭示KguSR及其靶基因的功能,解释了这套系统增加UPEC体内适应性的机制。