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研究背景弥漫大B细胞淋巴瘤（DiffuseLargeB cell Lymphoma,DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）中所占比例最高的一种B细胞淋巴瘤。近年来,利妥昔单抗和自体干细胞移植等新治疗措施的应用明显改善了 DLBCL的疗效,但仍有约40%的DLBCL病例进展为复发难治。从临床表现和基因表达谱来看,DLBCL是一组高度异质性肿瘤。近年来研究发现,c-Myc蛋白表达阳性DLCBL病例往往侵袭程度高,易结外浸润,对常规化疗如利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松联合化疗（R-CHOP）反应差,且总体生存率低。由于c-Myc蛋白具有半衰期短、代谢快以及其自身特殊bHLHZ（carboxy-terminal basic-helix-loop-helix-zipper）结构药物不易结合等特点,目前尚无有效的靶向治疗药物,被认为是最引人注目的抗肿瘤靶点之一。小檗胺（Berbamine）是一种天然植物提取结构特殊的双苄基异喹啉类生物碱药物,它作为一种免疫调节剂在国内临床应用多年。前期研究发现Berbamine对急慢性白血病、骨髓瘤、黑色素瘤、肝癌等多种肿瘤均具有抑制作用,但因治疗浓度较高阻碍了其临床应用。为了增进Berbamine的疗效,我们对其结构进行改造,发现4-氯苯甲酰小檗胺（4-chlorobenzoyl berbamine,CBBM）作为一种高效衍生物比原药具有更强的抗肿瘤活性。本课题首先对c-Myc表达阳性DLBCL病例进行临床分析,观察c-Myc表达阳性DLBCL的临床特点、治疗效果及对生存影响;同时,评价CBBM是否对c-Myc表达阳性DLBCL具有抗肿瘤作用并初步探讨其机制,为c-Myc表达阳性DLBCL的靶向性治疗提供新的思路。第一部分 c-Myc表达阳性在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中临床意义研究:116例初发弥漫大B细胞淋巴瘤病例临床分析目的:通过分析c-Myc表达阳性DLBCL的发生率、临床特点、治疗疗效以及对预后的影响,明确以c-Myc作为靶点对DLBCL的价值和意义。方法:回顾性分析2015年-2018年经浙江大学医学院附属XX血液科和浙江大学医学院附属XXX血液科治疗、病史资料完备的116例DLBCL病例,利用免疫组化的方法检测福尔马林固定石蜡包埋标本中c-Myc、BCL2、CD10、BCL6、MUM1、Ki-67的表达情况,分析c-Myc表达阳性与患者年龄、临床分期、国际预后指数评分（International Prognostic Index,IPI）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）、GCB/non-GCB亚型、Ki-67增殖指数、中枢神经系统浸润、胃肠道浸润、对治疗反应和总生存（Overall Survival,OS）的关系。结果:1.116例初发DLBCL患者中c-Myc表达阳性比例约占40.52%（47/116）,其中c-Myc高表达（>80%）占6.90%（8/116）,c-Myc和BCL2双阳性表达比例占34.48%（40/116）。2.与c-Myc表达阴性患者相比,c-Myc表达阳性DLBCL IPI评分较高（年龄大于60岁组）（p=0.033）、Ki-67指数倾向高增殖活性（>80%）（p=0.002）、更易发生中枢神经系统浸润（p =0.003）,而六个疗程后的完全缓解率（Complete rsaponse,CR）更低（p =0.028）。3.c-Myc表达阳性DLBCL患者中位生存时间为23个月,c-Myc表达阴性DLBCL患者中位时间未达到（p=0.005）;c-Myc、BCL2双阳性表达DLBCL患者中位生存时间为23个月,而其他组中位生存时间未达到（p=0.004）。结论:c-Myc表达阳性DLBCL患者表现为更具侵袭性的临床特点,对治疗的反应更差;c-Myc表达阳性和c-Myc、BCL2双阳性表达是影响DLBCL患者OS的不良预后因素。第二部分CBBM体外抑制c-Myc表达阳性弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖及其机制研究目的:通过比较Berbamine及其衍生物CBBM对DLBCL细胞增殖活性的抑制作用,观察不同浓度CBBM对DLBCL细胞凋亡诱导和周期阻滞影响,评价CBBM作为一种新的小分子抑制剂在DLBCL中的抗肿瘤潜能;通过观察CBBM对OCI-Ly3细胞c-Myc及其相关蛋白表达、自分泌白介素10（Interleukin 10,IL10）及其下游JAK2/STAT3信号转导通路的影响,明确CBBM抑制c-Myc表达阳性DLBCL细胞可能的分子机制。方法:1.应用MTT方法检测Berbamine及其新型衍生物CBBM对OCI-Ly3、OCI-Ly 10、U2932、SU-DHL 16和Pfeiffer五种DLBCL细胞系的增殖抑制作用;同样方法检测CBBM对两例健康供者外周血干细胞的增殖抑制影响,评价CBBM对正常血细胞的毒性作用。2.应用流式细胞术检测不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞前后凋亡细胞数量的变化和细胞周期分布情况。3.采用Western Blot技术检测不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞前后Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、PARP、Cleaved-PARP、LC3B 等凋亡和自噬相关蛋白的表达变化。4.采用Western Blot技术检测不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞前后c-Myc蛋白表达变化;实时定量PCR的方法检测不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞前后c-Myc mRNA水平的变化;观察MG132和/或CBBM共培养对OCI-Ly3细胞c-Myc蛋白水平表达变化来确定CBBM抑制c-Myc蛋白水平可能的机制。5.采用Western Blot技术检测CBBM靶分子CaMKIIγ在五种DLBCL细胞中的表达情况,并在OCI-Ly3细胞中验证CBBM对CaMKIIy和phosphate-CaMKIIy表达的影响。6.采用实时定量 PCR 方法检测 OCI-Ly3、OCI-Lyl0、U2932、SU-DHL16 和Pfeiffer细胞IL10 mRNA水平的表达,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测五种DLBCL细胞自分泌IL10的情况,并观察不同浓度CBBM处理前后对OCI-Ly3细胞mRNA水平和蛋白水平自分泌IL10的影响。7.采用 Western Blot 技术检测 CBBM 对 OCI-Ly3 细胞 IL10 下游 JAK2/STAT3信号转导通路、BCL2蛋白的影响。8.采用Western Blot技术检测外源性重组人IL10刺激后对JAK2/STAT3通路和c-Myc、BCL2的表达影响,并同时观察加入CBBM后的上述分子的表达变化。9.采用Western Blot技术检测不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞前后程序性死亡配体-1（Programmed death-1 ligand,PD-L1）蛋白表达的变化。结果:l.CBBM 对 OCI-Ly3、OCI-Lyl0、U2932、SU-DHL 16 和 Pfeiffer 五种 DLBCL细胞系 24h 的 IC50值分别为 1.39±0.04、2.56±0.04、3.89±0.07、1.82±0.05、3.73±0.06μmol/L,分别是 Berbamine 的 8.78±0.25、9.24±0.33、4.57±0.017、9.64±0.53 和7.01±0.031倍;CBBM10μmol/L高浓度作用下,对外周血干细胞的增殖并无明显抑制作用,存活率分别为87.93±4.70%和93.15±1.50%。CBBM对OCI-Ly3细胞的选择指数为7.20±0.22。2.凋亡分析发现经CBBM处理的OCI-Ly3细胞凋亡细胞数明显增加。而细胞周期分析表明经CBBM处理的OCI-Ly3细胞G0/G1期的细胞明显增加,S期、G2/M期数量明显减少。两种变化均随着药物浓度的升高更显著。3.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后,与对照组相比,总的Caspase 3、PARP 无明显变化,Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP、LC-3B 表达量明显增加。4.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后,与对照组相比,c-Myc mRNA水平和蛋白水平均下降,蛋白下降更明显。4μmol/LCBBM联合MG132组作用OCI-Ly3细胞6 h后c-Myc蛋白水平较CBBM组有一定程度的回升。5.通过分析CBBM对五种细胞的IC50值和CaMKIIγ的表达灰度值相关性发现两者具有显著相关性,R2=0.8269。经CBBM作用后OCI-Ly3细胞phosphate-CaMKIIγ和CaMKIIy蛋白表达明显下降。6.低浓度CBBM作用OCI-Ly3细胞后,与对照组相比,自分泌IL10水平明显下降,其中 48 h 组 1 μmol/L、2 μmol/L CBBM 处理后分别由 66.02 ± 033 pg/mL降至 38.99 ± 0.57 pg/mL、26.67 ± 0.47 pg/mL。7.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后,与对照组相比,phosphate-JAK2和phosphate-STAT3的表达明显下降,而检测其下游分子BCL2蛋白也发现明显下降。8.外源性重组人IL10可以增强phosphate-STAT3和c-Myc的表达。而CBBM能显著降低IL10引起的phosphate-STAT3、c-Myc、BCL2表达增高。9.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后,与对照组相比,c-Myc下游分子PD-L1表达明显下降,CBBM联合MG132组作用OCI-Ly3细胞PD-L1蛋白水平未见上升。结论:1.CBBM和Berbamine对DLBCL细胞均有增殖抑制作用,但CBBM比Berbamine具有更强的抗淋巴瘤活性。同时,CBBM选择性抑制DLBCL细胞的增殖,对外周血干细胞无明显毒性。2.CBBM阻止细胞进入细胞周期,通过激活细胞内凋亡和自噬相关蛋白诱导OCI-Ly3细胞凋亡。3.CBBM在mRNA水平和蛋白水平均可抑制OCI-Ly3细胞c-Myc的表达。其中对c-Myc蛋白水平的抑制更明显。这种抑制是可能通过蛋白酶体途径实现的,对c-Myc稳定因子CaMKIIγ及其磷酸化的抑制也可能是其机制之一。4.CBBM可以抑制OCI-Ly3细胞自分泌IL10的水平,但并不影响IL 10 mRNA的变化。CBBM通过抑制OCI-Ly3细胞自分泌IL10来调控JAK2/STAT3信号转导通路、c-Myc和BCL2的表达。5.CBBM可抑制c-Myc下游分子PD-L1的表达。