精神疾病和成瘾性精神障碍已经成为重要的公共卫生和社会问题,虽然这类疾病的临床表现各异,但中枢神经递质的异常在这类疾病的发生发展过程中都发挥着重要作用。1957年瑞典科学家阿尔维德·卡尔森(Arvid Carlsson)首先将多巴胺(dopamine, DA)确定为中枢神经系统中一种重要的神经递质,广泛参与学习记忆、运动、认知、情绪情感、行为动机和神经内分泌等多种生理功能的调节。多巴胺系统是近30年来神经科学领域研究的热点问题之一,许多神经精神疾病如帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)、精神分裂症(Schizophrenia)、Tourette综合征(Tourette syndrome, TS)、亨廷顿病、注意缺陷多动障碍(ADHD)、药物成瘾等均与多巴胺能神经递质传递异常有关。中枢多巴胺能系统的信号传递取决于突触间隙内的多巴胺浓度,而位于中枢多巴胺能神经元突触前膜上的多巴胺转运体(DA transporter, DAT)是调节和维持突触间隙内多巴胺浓度最重要的因子,是完成突触前膜重摄取突触间隙中多巴胺的物质基础。多巴胺转运体属于Na+、Cl-依赖性膜转运体蛋白家族,它的主要功能是重摄取突触间隙内的多巴胺,从而调控突触间隙内多巴胺的有效浓度和维持多巴胺能神经元间的信息传递。近期发现多个与DAT相互作用的受体或蛋白能够影响DAT的功能,如：多巴胺D2受体通过与DAT直接偶联促进DAT招募到细胞膜上,增强DAT对多巴胺的重摄取功能；a-synuclein与DAT的羧基末端结合促进DAT的重摄取功能,增加多巴胺诱导的细胞凋亡；Parkin通过与DAT的羧基末端结合并干扰DAT与a-synuclein或D2R的结合,从而对多巴胺引起的细胞毒性起保护作用；羧肽酶E(CPE)与DAT结合,增强DAT的重摄取功能。2007年英国研究小组和本实验分别发现人类CUL4B基因的丧失功能突变导致一种X连锁精神发育迟滞(X-linked mental retardation, XLMR)综合征,患者主要表现为精神发育迟滞、癫痫、震颤、步态异常、共济失调、失语、身材矮小和向心性肥胖等症状,该综合征患者表现有多巴胺能神经传递异常表型。CUL4B属于cullin基因家族,该家族成员是CULLIN-RING E3泛素连接酶复合体(CULLIN-RING ubiquitin Ligases, CRLs)的重要组成部分,主要发挥结构支架作用。CRLs是目前已知的最大的一类泛素连接酶,该复合物识别并降解特异性的底物,参与调节包括细胞周期、细胞信号传导、基因转录、生长发育以及DNA修复等几乎所有的生命活动。为研究CUL4B在多巴胺能神经元中的作用及其机制,本课题首先采用Cre/LoxP系统建立了多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠模型,并对该小鼠模型进行了表型分析。本课题主要分为以下两部分：第一部分多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠模型的建立Cre/LoxP重组酶系统的应用标志着基因敲除技术进入了一个崭新的时代,人们可以在特定组织、特定细胞和特定发育时期进行条件性基因敲除。实验室前期采用条件性基因敲除策略,成功建立了Cul4b基因打靶小鼠即Cul4b floxed小鼠,然后利用该Cul4b floxed小鼠与不同类型的Cre转基因小鼠杂交,获得Cul4b条件性基因敲除小鼠。实验室首先利用EIIa-Cre转基因小鼠与Cul4b floxed小鼠交配获得了Cul4b基因全身性敲除小鼠,发现Cul4b基因全身敲除导致小鼠在早期胚胎期死亡,提示CUL4B在个体发育过程中发挥重要作用。由于全身性敲除小鼠Cul4b基因导致小鼠胚胎期致死,限制了利用全身性敲除小鼠研究CUL4B功能。之后,实验室又利用Nestin-Cre转基因小鼠与Cul4b floxed基因打靶小鼠交配获得了神经系统特异性Cul4b敲除小鼠,发现该小鼠存在学习和记忆能力缺陷。基于以上研究,本课题利用Slc6a3-Cre转基因小鼠与Cul4b floxed基因打靶小鼠交配以获得多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠模型。取得了以下结果：1.采用两轮交配的方式获得多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠和对照小鼠：先将雌性Cul4bflox/flox小鼠与雄性Slc6a3-cre+/-转基因小鼠交配,得到了多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠(Slc6a3-cre+/-;Cul4bflox/Y),然后再用得到的多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠(Slc6a3-cre+/-;Cul4bflox/Y)与雌性Cul4bflox/flox小鼠交配,所产生的子代中雌雄各有50%为基因敲除小鼠,采用PCR方法对小鼠的基因型进行了鉴定,证实预期结果。2.为了确定该小鼠模型中Cul4b基因敲除的特异性和有效性,我们用免疫荧光方法对小鼠黑质区多巴胺能神经元进行TH和Cul4b免疫荧光双染色,结果显示,在中脑黑质区多巴胺能神经元中未检测到Cul4b蛋白的表达,说明多巴胺能神经元中的Cul4b基因被成功敲除,小鼠模型建立成功。第二部分多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠的表型分析通过上述交配策略可以得到多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠(Cul4bSlc6a3-Cre小鼠),并验证了该小鼠的多巴胺能神经元中的Cul4b基因被成功敲除,说明该小鼠模型建立成功。然后我们对该小鼠模型进行了表型分析,取得了以下研究结果：1.首先利用H&E染色分析了不同发育时期多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的脑组织切片,结果显示多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠的中脑和纹状体区的组织结构没有明显异常。2.利用TH抗体对多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠的中脑腹侧部位进行免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色分析,结果显示与同窝对照小鼠相比,多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠中脑腹侧的多巴胺能神经元的数目、分布和形态没有明显差异。3. TUNEL原位凋亡检测结果显示,多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠的中脑部位细胞凋亡没有明显变化。4.我们利用免疫组织化学染色方法对多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠中脑黑质和纹状体内的DAT表达水平进行检测,结果发现与同窝对照小鼠相比,敲除小鼠中脑黑质和纹状体内的DAT的表达水平没有明显变化。随后我们又利用Western blotting实验分析了敲除小鼠中脑黑质和纹状体内的TH和DAT的表达水平,也未检测到这两种蛋白的表达异常。5.我们对多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠进行了长期观察(>1.5年),并未发现敲除小鼠存在明显发育异常。利用Morris水迷宫、旷场实验和转棒实验分析了多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠的行为学变化。Morris水迷宫证实,多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠的空间学习记忆能力与对照组小鼠相比没有显著差异。旷场实验证实,多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠的自主运动能力与焦虑水平与对照组小鼠相比没有明显差异。转棒实验发现该小鼠的运动协调及抗疲劳能力亦没有明显变化。综上所述,本课题成功获得了多巴胺能神经元特异性Cul4b基因敲除小鼠。该敲除小鼠发育大体正常,组织学分析未发现明显异常,行为学分析也未发现明显异常。初步分析显示,敲除多巴胺能神经元中的Cul4b基因并不影响小鼠的多巴胺能神经传递。