【摘 要】
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在植物乳杆菌中,低聚果糖(FOS)的代谢受到全局调控和局部调控的双重作用。前期研究发现,Ccp A已被确定为植物乳杆菌参与FOS代谢的全局调控因子,但是关于局部调控的作用仍不清
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在植物乳杆菌中,低聚果糖(FOS)的代谢受到全局调控和局部调控的双重作用。前期研究发现,Ccp A已被确定为植物乳杆菌参与FOS代谢的全局调控因子,但是关于局部调控的作用仍不清晰。为了探究植物乳杆菌代谢FOS局部转录调控机制,本课题以SacR1和SacR2蛋白为研究对象,通过体内外实验验证了这两个蛋白与两个基因簇启动子区域结合位点(TFBS)的特异性结合;利用Ch IP-seq实验探究了SacR1和SacR2蛋白的调控基因,并与Ccp A所调控的基因共同分析,构建了植物乳杆菌代谢FOS的调控网络。论文主要结论如下:(1)为了分析SacR1和SacR2在代谢FOS过程中发挥的作用,分别构建了Δsac R1和Δsac R2两个基因敲除菌株并比较其与野生型的生长和代谢差异。在同一碳源下比较,三株菌的生长曲线和生长速率没有显著差别,考虑到可能是由于葡萄糖的存在而导致全局调控的作用比较显著,故选择了核糖作为碳源进行下一步研究。与核糖相比,当野生型菌株以FOS为碳源时,三个关键基因的表达量都发生了显著上调;相反,在sac R1和sac R2基因失活后,这些关键基因的表达没有发生显著的变化,表明了SacR1和SacR2可能作为阻遏蛋白参与到FOS代谢过程中,FOS可以起到诱导或去阻遏作用。通过预测,在sac PTS1和sac PTS26两个基因簇中的3个启动子区域共找到了4个潜在的TFBS。(2)为了验证SacR1和SacR2蛋白与TFBS的结合,分别构建了两个蛋白的大肠杆菌外源表达载体。重组表达后的蛋白通过EMSA实验验证,证实了SacR1和SacR2与3个启动子区域的4个TFBS的特异性结合。为了进一步验证SacR1和SacR2蛋白与TFBS的体内结合,分别构建了两个过表达载体,Ch IP-q PCR分析得出转录因子对启动子区域的DNA片段具有很高的富集,再次证明了SacR1和SacR2与TFBS的相互作用。(3)为了寻找SacR1和SacR2蛋白所调控的基因,对这两个局部转录调控因子结合的TFBS进行了全基因组扫描。通过Ch IP-seq实验发现,409-Flag-sac R1共捕获到100个peaks,共有121个可以匹配到CDSs上,10个可以匹配到基因区间;409-Flag-sac R2共捕获到108个peaks,共有111个可以匹配到CDSs上,24个可以匹配到基因区间。大多数潜在的TFBS位于编码特定碳水化合物分解代谢相关功能的操纵子上游,表明了SacR1和SacR2可能参与了相关调控。最后对植物乳杆菌代谢FOS的机制进行了全面分析,植物乳杆菌中FOS的代谢是一个极其复杂的调控网络,在该网络中,全局和局部调控因子的共同作用协调了各种单元的转录,使植物乳杆菌能够更好地利用碳源。
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