【摘 要】
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目的:全球约有8亿人以上患有慢性肝病,肝脏疾病已经成为人类疾病发病和死亡的主要因素之一。本实验旨在探究J-1048作为激活素受体样激酶5（ALK5）小分子抑制剂,体内通过注射硫代乙酰胺（TAA）诱导与体外TGF-β刺激LX2细胞建立纤维化模型,探究J-1048对抗肝纤维化机理,为肝纤维化的临床候选药物提供新的选择。方法:1.化学合成:金成华老师课题组设计合成吡唑衍生物J-1048,通过酶促测定中评
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目的:全球约有8亿人以上患有慢性肝病,肝脏疾病已经成为人类疾病发病和死亡的主要因素之一。本实验旨在探究J-1048作为激活素受体样激酶5（ALK5）小分子抑制剂,体内通过注射硫代乙酰胺（TAA）诱导与体外TGF-β刺激LX2细胞建立纤维化模型,探究J-1048对抗肝纤维化机理,为肝纤维化的临床候选药物提供新的选择。方法:1.化学合成:金成华老师课题组设计合成吡唑衍生物J-1048,通过酶促测定中评估J-1048对ALK5和p38αMAP激酶抑制活性,阳性对照药物选择LY-2157299和EW-7197。2.体外实验:选用人肝星状细胞（LX2）给予0-100μM的J-1048孵育24小时,MTT检测J-1048对LX2细胞存活率影响;提取细胞总蛋白,通过Western blot分析LX2细胞中α-SMA、CollagenⅠ、TGF-βRⅠ、Smad2/3、PSmad2/3和Smad7蛋白水平。通过免疫荧光双染α-SMA/Smad7和CollagenⅠ/TGF-βRⅠ观察TGF-β/SMAD信号通路与肝纤维化标志物的关系。3.体内实验:选用C57BL/6雄性小鼠,将小鼠随机分为正常组、硫代乙酰胺组（TAA）、低剂量给药组（TAA+1048-12.5 mg/kg）,高剂量给药组（TAA+1048-25 mg/kg）,阳性对照组（TAA+LY-2157299-50 mg/kg）和单独给药组（1048-25 mg/kg）。血清检测转氨酶水平（ALT/AST）;通过H＆E、Masson、Sirius red染色观察肝脏组织病理学变化;通过Western blot分析小鼠肝脏中肝纤维化指标（α-SMA、CollagenⅠ、TGF-βRⅠ、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad7）、炎症因子（P2X7r、NLRP3、IL-1β）蛋白水平;通过免疫组织化学染色进一步观察肝纤维化因子（α-SMA、CollagenⅠ）、免疫细胞（F4/80、MPO）表达情况;通过免疫荧光双染α-SMA/Smad7和CollagenⅠ/TGF-βRⅠ观察TGF-β/SMAD信号通路与肝纤维化标志物的关系。结果:合成部分:酶促测定的数据结果显示出J-1048对于ALK5有明显的抑制作用。体外实验:J-1048可以降低活化的LX2中α-SMA、CollagenⅠ、TGF-βRⅠ、PSmad2/3蛋白水平并恢复Smad7蛋白水平。体内实验:J-1048可以减轻由TAA诱导的小鼠肝纤维化ALT、AST水平;H＆E、Masson和Sirius red染色表明通过给予J-1048后小鼠肝组织的损伤与胶原沉积现象得到改善;Western blot结果表明,J-1048显著抑制肝纤维化进程中（α-SMA、CollagenⅠ、TGF-βRⅠ、P-Smad2/3）表达水平,降低P2X7r、NLRP3、IL-1β等炎症因子的释放,恢复Smad7表达水平;免疫组织化学染色结果表明J-1048可以减少由TAA诱导的肝纤维化因子（α-SMA、CollagenⅠ）阳性染色、降低免疫细胞（F4/80、MPO）的募集;免疫荧光双染（α-SMA/Smad7、CollagenⅠ/TGF-βRⅠ）,结果表明通过给予J-1048治疗后可以恢复Smad7表达水平并抑制α-SMA的表达;J-1048治疗后可以抑制TGF-βRⅠ的同时抑制CollagenⅠ表达水平。结论:本实验设计合成的吡唑衍生物J-1048对于ALK5有明显的抑制活性。J-1048可以改善TAA诱导的肝纤维化标志物的升高,J-1048作为ALK5抑制剂通过抑制TGF-β途径降低Smad2/3的磷酸化,恢复Smad7蛋白水平,并且通过SMAD信号通路抑制由TAA诱导的小鼠肝纤维化。并且J-1048可以通过抑制P2X7R/NLRP3信号通路来抑制炎性因子IL-1β的产生,从而对于治疗肝纤维化起到积极作用。最后,通过免疫组化与免疫荧光染色,J-1048可以减少TAA导致的巨噬细胞和中性粒细胞的聚集。ALK5小分子抑制剂J-1048有望成为抗肝纤维化药物的候选药物。
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