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目的:1.建立RHD基因Rhesus盒(Rhesus box)焦磷酸检测方法。2.建立RHC/c等位基因焦磷酸检测方法。3.评价并应用所建立的RHD基因Rhesus盒和RHC/c等位基因焦磷酸检测方法。方法:1.采用抗-D、抗-C、抗-c单克隆抗体鉴定样本Rh表型,对于RhD抗原阴性的样本,采用改良的间接抗球蛋白试验(Indirect antiglobulin test,IAT)进行确认。2.在前期研究基础上,根据已使用错配聚合酶链反应-序列特异性引物方法(Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primer,PCR-SSP)检测样本RHD基因Rhesus盒合子型的结果选择本次实验样本。针对位于各样本RHD基因上游、下游和杂合Rhesus盒上的多态性位点设计引物,扩增包含该多态性位点的DNA片段,应用焦磷酸测序技术对扩增产物进行测序。根据焦磷酸测序结果,区分样本RHD+/RHD+纯合子、RHD+/RHD+杂合子和RHD-/RHD-纯合子这三种基因型。3.为验证RHD基因Rhesus盒焦磷酸测序结果的准确性,将焦磷酸测序扩增所得产物全部进行Sanger测序,测序完成后,将Sanger测序所得的序列在Genebank中进行BLAST比对,并对焦磷酸测序和Sanger测序这两种方法测得的结果进行比较分析。同时将焦磷酸测序方法检测RHD基因Rhesus盒合子型的结果与前期研究中错配PCR-SSP检测的RGD基因Rhesus盒合子型结果进行比较。4.根据RhC和Rhc抗原检测结果挑选RHC/c等位基因焦磷酸测序研究的样本。针对RHD基因和RHCE基因3号外显子(exon)上nt455位多态性位点设计序列特异性引物,特异性扩增RHCE基因整个2号外显子。以扩增所得特异性产物为模板,在此基础上根据RHC和RHc等位基因nt178位多态性位点设计引物,扩增出包含该多态性位点的DNA片段。应用焦磷酸测序技术对二次扩增产物进行测序,根据焦磷酸测序检测结果,分析样本RHCC等位基因型、RHCc等位基因型和RHcc等位基因型检测结果。5.为验证RHC/c等位基因焦磷酸测序结果的准确性,将PCR-SSP方法扩增所得整个2号外显子的特异性产物和扩增RHC/c等位基因含nt178位多态性位点所得的DNA片段产物均进行Sanger测序。测序完成后,将Sanger测序所得全部序列在Genebank中进行BLAST比对,并对焦磷酸测序结果和Sanger测序结果进行比较分析。结果:1.用于检测和验证RHD基因Rhesus盒合子型焦磷酸测序方法的样本共96例,其中,表型为RhD阳性样本36例(37.50%),RhD阴性样本60例(62.50%)。2.所有96例样本中,应用焦磷酸测序方法检出RHD+/RHD+纯合子型32例(33.33%),其胞嘧啶(C)和胸腺喹定(T)含量分别为(50.84±2.08)%(mean±S.D.,95%CI:50.09%～51.59%)和(49.22±2.12)%(mean±S.D.,95%CI:48.45%～49.98%)。检出PHD+/PHD-杂合子型36例(37.50%),其C和T含量分别为(66.78±1.82)%(mean±S.D.,95%CI:66.16%～67.39%)和(33.22±1.82)%(mean±S.D.,95%CI:32.61%～33.84%)。检出RHD-/RHD-纯合子型28例(29.17%),其C和T含量分别为(97.86±1.21)%(mean±S.D.,95%CI:97.39%～98.33%)和(2.14+1.21)%(mean±S.D.,95%CI:1.67%～2.61%)。胞嘧啶(C)含量比较:以上三个组胞嘧啶含量分布存在统计学差异(P=5424.99,P=0.00);PHD+/RHD+纯合子型组与RHD+/RHD-杂合子型组相比较,胞嘧啶(C)含量分布存在统计学差异(t=137.41,P=0.00),RHD+/RHD纯合子型组与PHD-/RHD-纯合子型组相比较,胞嘧啶(C)含量分布存在统计学差异(t=222.60,P=0.00),RHD+/RHD-杂合子型组与RHD-/RHD-纯合子型组相比较,胞嘧啶(C)含量分布存在统计学差异(t=425.48,P=0.00)。胸腺嘧啶(T)含量比较:以上三个组胸腺嘧啶(T)含量比较存在统计学差异(F=5340.90,P=0.00);RHD+/RHD+纯合子型组与RHD+/RHD-杂合子型组相比较,胸腺嘧啶(T)含量分布存在统计学差异(t=228.57,P=0.00),RHD+/RH+纯合子型组与RHD-/RHD-纯合子型组相比较,胸腺嘧啶(T)含量分布存在统计学差异(t=336.29,P=0.00),RHD+/RHD-杂合子型组与RHD-/RHD-纯合子型组相比较,胸腺嘧啶(T)含量分布存在统计学差异(t=444.00,P=0.00)。3.前期研究当中,错配PCR-SSP实验检测到RHD+/RHD+纯合子样本32例(33.33%),RHD+/RHD-杂合子型样本39例(40.63%),RHD-/RHD-纯合子样本25例(26.04%)。从数据上看,错配PCR-SSP检测结果和焦磷酸测序检测结果之间只有3例不相同,实际上错配PCR-SSP方法将4例焦磷酸测序检测为RHD-/RHD-纯合子的样本检测成RHD+/RHD-似合子,将1例焦磷酸测序检测为RHD+/RHD-杂合子的样本检测成RHD-/RHD-纯合子,即二者有5例样本结果不相同。二者结果相比较无统计学差异(X2=0.03,P=0.06)。4.用Sanger测序方法检出RHD-/RHD-纯合子型28例(29.17%),这28例阴性纯合子样本的检测结果与焦磷酸测序结果相同。但因Sanger测序不可定量检测基因多态性,所以从Sanger测序峰图上无法完全区分RHD+/RHD合子与RHD+/RHD-杂合子这两种基因型,即Sanger测序共检出RHD+/RHD纯合子型样本与RHD+/RHD-杂合子型样本 68 例(70.83%)。5.用于建立RHC/c等位基因焦磷酸测序方法的样本共68例。其中,表型为RhCC样本 30 例(44.12%),RhCc 样本 30 例(44.12%),Rhcc 样本 8 例(11.76%)。6.焦磷酸测序方法检测RHC/c等位基因结果显示,RHCC纯合子30例(44.12%),腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的含量分别为(96.17±4.14)%(mean±S.D.,95%CI:94.62%～97.71%)和(3.83士4.14)%(mean±S.D.,95%CI:2.29%～5.38%)。RHCc 杂合子 30例(44.12%),腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的含量分别为(45.97±3.95)%(mean±S.D.,95%CI:44.49%～47.44%)和(54.07±3.96)%(mean±S.D.,95%:CI 52.59%～55.54%)。RHcc纯合子8例(11.76%),腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的含量分别为(3.38士3.34)%(mean±S.D.,95%CI:0.59%～6.16%)和(96.63±3.34)%(mean±S.D.,95%CI:93.84%～94.41%)。腺嘌呤(A)含量比较:以上三个组腺嘌呤(A)含量分布存在统计学差异(F=2219.77,P=0.00);RHCC纯合子型组与RHCc杂合子型组比较,腺嘌呤(A)含量分布存在统计学差异(t=126.54,P=0.00),RHCC纯合子型组与RHcc纯合子型组比较,腺嘌呤(A)含量分布存在统计学差异(t=63.85,P=0.00),RHCc杂合子型组与RHcc纯合子型组比较,腺嘌呤(A)含量分布存在统计学差异(t=3.25,P=0.00)。胞嘧啶(C)含量比较:以上三个组胞嘧啶(C)含量分布存在统计学差异(F=2218.91,P=0.000);RHC 纯合子型组与RHCc杂合子型组比较,胞嘧啶(C)含量分布存在统计学差异(t=5.04,P=0.00),RHCC纯合子型组与PHcc纯合子型组比较,胞嘧啶(C)含量分布存在统计学差异(t=75.10,P=0.00),RHCc杂合子型组与RHcc纯合子型组比较,胞嘧啶(C)含量分布存在统计学差异(t=81.89,P=0.00)。以上结果表明,焦磷酸测序检测RHC/c等位基因三组结果分布差异有统计学意义。7.Sanger测序检测PCR-SSP方法扩增所得产物结果表明,产物包含PHCE基因整个2号外显子序列。Sanger测序检测PHC/c等位基因nt178位多态性位点扩增产物结果表明,RHCC纯合子30例(44.12%),RHCc杂合子30例(44.12%),RHcc纯合子8例(11.76%),该结果与焦磷酸测序方法检测结果完全一致。结论:1.本研究建立了使用焦磷酸测序技术检测RHD基因Rhesus盒合子型的方法,并由此得出RHD基因型,该方法快速、准确,无须电泳,适用于大量临床标本的检测。2.本研究建立了使用焦磷酸测序技术检测PRHC/c等位基因的方法,使用焦磷酸测序技术检测RHC/c等位基因,充分利用焦磷酸定量检测的特性,可避免因基因突变或序列同源等问题造成的RHC等位基因检测过程中出现的假阴性或假阳性结果,首次建立了可准确检测RHC等位基因的方法。