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镉(Cd)是环境中常见的蓄积性重金属毒物,能造成机体多系统和多器官的损伤。大脑是Cd毒性作用的重要靶器官之一,Cd可以引起血脑屏障功能障碍,进入脑组织引起神经元凋亡。死亡受体通路是细胞经典凋亡通路之一,Fas/FasL信号转导通路是主要死亡受体通路之一。有研究表明,Fas/FasL信号转导通路可介导线粒体通路引起细胞凋亡。本课题组前期研究结果表明,Cd可经线粒体通路引起细胞凋亡,但Fas/FasL信号转导通路在Cd致神经细胞凋亡中的作用及对线粒体通路调控机制尚未阐明。本研究以原代大鼠大脑皮质神经元和PC-12细胞为模型,通过体外试验探讨了Fas/FasL信号转导通路在Cd诱导神经细胞凋亡中的作用及对线粒体凋亡通路的调控机制,并研究了N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)在上述过程中的保护作用。1. Fas/FasL信号转导通路在镉致神经细胞凋亡中的作用为研究Cd对神经细胞Fas/FasL信号转导通路的影响,本试验以原代大鼠大脑皮质神经元和PC-12细胞为模型,用不同浓度(0、5、10、20μmol/L)醋酸镉(CdAc2)处理原代大鼠大脑皮质神经元和PC-12细胞不同时间(0、6、12、24 h),western blot检测Fas/FasL信号转导通路相关蛋白Fas、FasL、FADD和cleaved caspase-8的表达。结果表明,随着Cd剂量的增加,Fas、FasL、FADD和cleaved caspase-8的表达量显著或极显著高于对照组(p<0.05或p<0.01)；随着Cd处理时间的增加,Fas、FasL、FADD和cleaved caspase-8的表达量均显著或极显著高于对照组(p<0.05或p<0.01)。为研究Fas/FasL信号转导通路在镉致神经细胞凋亡中的作用,用10μmol/L CdAc2与 40 μmol/L Z-IETD-FMK (caspase-8特异性抑制剂)或40mg/L Anti-FasL (FasL中和抗体)单独及联合处理原代大鼠大脑皮质神经元和PC-12细胞24h, Annexin V-FITC/PI双染,利用流式细胞术检测凋亡率：hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞核的形态学变化；Annexin V-FITC染色,荧光显微镜观察户nnexin V-FITC阳性细胞。结果表明,Z-IETD-FMK能极显著抑制Cd引起的细胞核固缩、浓染、碎裂及轴突、树突神经网络消失等典型的凋亡形态变化并降低凋亡率(p<0.01)。Anti-FasL可极显著抑制Cd所致的细胞凋亡率升高(p<0.01)。说明Fas/FasL信号转导通路在Cd诱导的神经细胞凋亡中发挥重要作用。2. Fas/FasL信号转导通路在镉致神经细胞凋亡线粒体通路中的作用为研究Fas/FasL信号转导通路在Cd诱导神经细胞凋亡线粒体通路中的作用,10μmol/L CdAc2和40 μmol/L Z-IETD-FMK或40 mg/L Anti-FasL单独及联合处理原代大鼠大脑皮质神经元或PC-12细胞24 h。western blot检测线粒体凋亡通路相关蛋白,如cyt c释放,BID、caspase-9、 caspase-3和PARP活化水平及Bax和Bcl-2表达变化；流式细胞术结合荧光探针检测线粒体膜电位(△φm)变化。结果表明,Z-IETD-FMK可以阻断Cd引起的△Ψm下降,线粒体内cyt c释放,BID、caspase-9、caspase-3和PARP的活化及B cl-2/Bax的降低(p<0.01或p<0.05)；Anti-FasL可以极显著抑制线粒体通路相关蛋白caspase-9、 caspase-3和PARP的活化(p<0.01)。说明Fas/FasL信号转导通路的激活参与调控Cd诱导的神经细胞凋亡线粒体通路。3. NAC在镉诱导神经细胞凋亡Fas/FasL信号转导通路中的保护作用为研究NAC在Cd诱导神经细胞凋亡Fas/FasL信号转导通路凋亡中的保护作用,本研究用10μmol/L CdAc2 与 100 μmol/L NAC单独或联合处理PC-12细胞24 h。流式细胞术和Hochest 33258检测细胞凋亡率, western blot检测Fas/FasL信号转导通路相关蛋白Fas/FasL、 FADD和cleaved caspase-8的表达。结果表明,NAC能极显著抑制Cd引起的PC-12细胞凋亡率升高及Fas、FasL、FADD和cleaved caspase-8表达量升高(p<0.01)。表明NAC对Cd诱导的Fas/FasL凋亡信号转导通路具有保护作用。