产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,CP)属梭状芽孢杆菌属,是一种重要的人兽共患病病原。该病的防控主要依赖于疫苗的免疫接种,现有的疫苗由全菌及类毒素灭活制备,存在注射剂量大、家畜接种局部反应较重等问题。鉴于以上原因,本试验试图融合表达β、ε毒素不同片段,并将表达产物免疫家兔,通过攻毒保护和血清中和试验比较其免疫原性,从而筛选出可提供足够免疫保护的毒素片段,以制备含有两种毒素保护性抗原的融合蛋白,为今后多价基因工程类毒素疫苗的研制奠定理论基础。　　 为分析β,ε毒素不同截短片段的免疫原性,通过DNAstar软件分析两毒素蛋白质的二级结构,根据亲水性基团的分布,截取毒素成熟肽序列上不同片段,通过PCR扩增获得三个不同组合的融合基因并克隆入pET-32a(+)载体中,诱导表达得到三个重组融合蛋白,分别命名为ε1～432～β1-610、β419～927-ε430～889、β-ε。分别将融合蛋白以1mg/只的剂量免疫家兔,首免后14天以相同剂量加强免疫一次。分别测定首免后14天,二免后7天家兔血清的中和抗体效价,并于二免7天后分别以1MLD的产气荚膜梭菌C型毒素,D型毒素进行攻毒试验,测定攻毒保护结果。结果表明:对C型毒素,ε1-432-β1～610、β419～927-ε430-889、β-ε的一免血清均不能中和C型毒素,二免血清中只有β-ε免疫动物可中和1MLD的C型毒素,攻毒保护结果分别为0/4、0/4、2/4,由此推测β毒素的免疫保护性依赖于毒素全长的完整性。对D型毒素,ε1～432=β1～610、β419～927-ε430～889、β-ε的一免血清中和效价分别为4,1,40,二免血清中和效价分别为80,1、160,攻毒保护结果为4/4、1/4,4/4,由此推测ε,ε1～432均可提供有效保护,而ε430～889免疫原性弱,不能提供有效保护,表明ε毒素的主要保护性抗原位于N端的ε1-432区域内。　　 根据以上结果,构建了ε1-432-β融合基因并获得表达。将获得的ε1～432-β融合蛋白以0.1mg/只剂量免疫家兔,首免后14天加强免疫一次,测定血清中和效价及免疫攻毒结果。结果表明:对C型毒素,ε1～432=β0.1mg/只免疫组一免血清中和效价为0,二免血清中和效价为16,攻毒保护结果为3/3。对D型毒素,一免血清中和效价为0,二免血清中和效价为0,攻毒保护结果为3/3。　　 结果表明,ε1～432-β融合蛋白可对β毒素提供足够保护,而对ε毒素不能保护,这与ε1～432-β1～610可对ε毒素提供保护的结果相矛盾。初步推测为毒素片段免疫原性的强弱主要依赖于其表位构象。当毒素表达蛋白越接近于其天然构象时,免疫原性越强,反之越弱。从ε1-432-β1-610到ε1～432-β,ε1-432片段的免疫原性于后者大为减低甚至丧失,推测当ε1～432与片段较大的β融合时,其表位构象较大受到β毒素影响,故免疫原性变弱。比较β-ε到ε1～432-β,β片段的免疫原性也有明显增强,推测是由于ε1～432片段较小,对其表位构象的抑制作用也较小。这一推论有待相关实验进一步证实。