子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是一种常见的妇科疾病，是指具有生物活性的子宫内膜组织出现在子宫体以外的身体其他部位。EMS虽为良性疾病，但却有着与恶性肿瘤相似的某些生物学特性。虽其发病机理尚未完全明了，但目前大量的临床和基础研究显示，EMS与免疫炎症反应和血管生成有着密切的关系，其中腹腔内的免疫细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNFα、VEGF等)的含量及活性改变被认为是EMS发生的主要分子基础；而且，以VEGF等血管调控因子介导的血管生成是其发展的必要环节。人β-防御素2(humanβdefensin，hBD-2)是一种内源性抗菌肽，存在于包括生殖器官在内的各种粘膜上皮组织中，在调节细胞免疫和体液免疫中发挥着重要作用，是联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。已证实其具有抗病原微生物、抗感染和抗肿瘤血管生成的作用。体外研究表明，炎症细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNFα等)能诱导并上调hBD-2的表达。动物实验发现，hBD-2的过度表达又可以抑制IL-1β、IL-6、TNFα和VEGF的生成。这些研究提示hBD-2可能具有抗免疫炎症反应及抗血管生成的作用。既往许多研究已经揭示了EMS的发病机制与免疫炎症反应及血管生成有关，那么，hBD-2是否也能通过抗免疫炎症反应及抗血管生成的作用抑制EMS的发生和发展呢?迄今为止，hBD-2与EMS的关系如何、其在人EMS在位及异位内膜组织中的表达及其作用如何等问题，均尚无文献报道。因此，本研究首先检测EMS和子宫腺肌病(adenomyosis，AM)患者异位和在位内膜组织中hBD-2的基因和蛋白表达情况，并研究其表达与炎性细胞因子的相关性。然后，建立EMS大鼠模型，并构建hBD-2的逆转录病毒重组质粒，观察hBD-2基因转染对EMS的影响，从而探讨其对EMS的作用及机制。本文从以下三个部分进行了研究。　　 第一章人β-防御素2在人子宫内膜异位症和子宫腺肌病组织中的表达。　　 目的：检测EMS和AM患者的异位和在位内膜组织以及正常子宫内膜组织中hBD-2的基因和蛋白表达水平，了解hBD-2在EMS和AM发病中的作用。　　 方法：选择EMS(卵巢异位囊肿)、AM和对照组患者各25例。分为EMS异位内膜组(EMS患者卵巢异位囊肿壁组织)、EMS在位内膜组(EMS患者子宫内膜组织)、AM异位内膜组(AM患者肌壁间异位病灶组织)、AM在位内膜组(AM患者子宫内膜组织)和对照组(正常子宫内膜组织)。首先采用Real-time PCR检测各组内膜组织中hBD-2、IL-1β、IL-6、TNFα和NF-κB的的mRNA表达水平，分析它们分别在EMS异位和在位内膜组织中、AM异位和在位内膜组织中的的mRNA表达水平的差异，和正常子宫内膜组织中的表达水平差异，以及EMS不同临床分期中异位和在位内膜组织中hBD-2的的mRNA表达水平的差异，同时分析hBD-2与IL-1β、IL-6、TNFα和NF-κB的的mRNA表达水平的相关性。然后采用Western-blot进一步检测各组组织中hBD-2的蛋白表达。　　 结果：各组内膜组织中均存在hBD-2的mRNA和蛋白表达。hBD-2在EMS异位内膜组、EMS异位内膜组、AM异位内膜组、AM在位内膜组和对照组的内膜组织中的的mRNA表达水平(中位数)分别为：0.3684、0.0343、0.0320、0.0530和0.0034；蛋白表达水平(均数±标准差)分别为：1.360±0.331、0.783±0.250、0.963±0.241、0.891±0.195和0.746±0.223。将各组内膜组织中hBD-2的mRNA和蛋白表达水平进行比较，EMS异位内膜组显著高于在位内膜组和对照组(P＜0.05)，AM异位内膜组显著高于对照组(P＜0.05)。EMS和AM在位内膜组与对照组无显著差异(P＞0.05)。将EMS不同临床分期的异位内膜组织中hBD-2的的mRNA表达水平进行比较，Ⅰ期与Ⅱ期显著高于Ⅲ期与Ⅳ期(P＜0.05)。EMS异位内膜中hBD-2与NF-kB、TNF-α、IL-1β的的mRNA表达水平均呈正相关性(P＜0.05)。　　 第二章携带人β-防御素2基因的逆转录病毒载体的构建及其鉴定。　　 目的：构建hBD-2逆转录病毒表达载体。　　 方法：选择hBD-2为目标基因，以逆转录病毒作为基因转移工具，采用双酶切定位定向克隆技术构建重组质粒PLXSN-hBD2，将其导入感受态大肠杆菌扩增，PCR电泳鉴定双酶切正确。　　 结果：采用基因测序的方法鉴定构建hBD-2重组质粒(PLXSN-hBD2)成功。　　 第三章人β-防御素2基因转染子宫内膜异位症SD大鼠模型的疗效观察。　　 目的：观察hBD-2基因转染EMS大鼠模型后的治疗效果，并进一步分析其作用机理。　　 第一节子宫内膜异位症SD大鼠模型的建立。　　 方法：采用自体子宫内膜移植法建立EMS的SD大鼠模型。　　 结果：选取同时有2个成模病灶的大鼠为实验对象。　　 第二节人β-防御素2基因转染子宫内膜异位症大鼠模型。　　 方法：预实验中分别在大鼠异位病灶局部多点注射2μg和0.2μg重组质粒pLXSN-hBD2进行基因转染，2天后PCR、Western-blot检测异位病灶组织内基因组DNA和蛋白表达，进行外源基因转染整合的鉴定。同时观察两种剂量转染后2、7、14天异位病灶组织中hBD-2的蛋白表达变化，以确定疗效观察中重组质粒的用药剂量和时间。　　 结果：局部多点注射重组质粒pLXSN-hBD2能将hBD-2基因成功转染到大鼠模型异位病灶组织中。选择两周一次，每次每个病灶2μg重组质粒治疗EMS大鼠模型。　　 第三节人β-防御素2基因转染大鼠EMS模型的疗效观察。　　 方法：⑴选取实验对象大鼠31只，随机分为PLXSN-hBD2转染组(11只)、PLXSN载体对照组(10只)和PBS空白对照组(10只)三组。⑵观察三组转染前后异位病灶的体积变化。采用免疫组化、Real-time PCR分别检测转染后异位病灶组织中微血管密度(MVD)的变化和IL-1β、TNF-α、NF-kB的mRNA表达水平。⑶利用光镜和电镜观察转染后异位病灶的组织形态学和超微结构改变。⑷ELISA(酶标法)检测转染前后大鼠血清中VEGF的水平，放免法检测转染后大鼠血清中卵巢激素(E2、P、FSH、LH)水平的变化。　　 结果：①转染后2周，PLXSN-hBD2组异位病灶体积明显小于PLXSN组和PBS对照组(p＜0.01)，小于用药前病灶体积(p＜0.01)。PLXSN-hBD2组MVD明显低于两对照组(P＜0.01)，IL-1β、TNF-α和NF-kBmRNA的表达也显著低于两对照组(p＜0.05)。②转染后2周，PLXSN-hBD2组异位内膜组织中，光镜下可见内膜腺体明显减少，腺腔狭窄，细胞稀疏，呈萎缩状态；电镜下可见细胞萎缩，细胞核固缩，绒毛基本消失，线粒体肿胀等现象。两对照组光镜下可见腺体丰富，增生明显，腺上皮细胞排列整齐，周围血管丰富；电镜下可见细胞形态大小正常，细胞核形态规则，微绒毛密集，细胞器正常。③转染后2周，PLXSN-hBD2组血清VEGF明显低于PLXSN组及PBS对照组(P＜0.01)，也明显低于转染前(P＜0.01)。而三组卵巢激素水平无明显差异(P＞0.05)。　　 结论：⑴EMS患者异位内膜组织中hBD-2的高表达可能参与了EMS的发生。⑵局部注射hBD-2重组质粒可成功实现大鼠体内基因转染，并在体内获得hBD-2的蛋白表达。⑶hBD-2基因可能通过抗免疫炎症的作用，以及直接或间接的抗血管生成作用对EMS大鼠模型体内异位病灶的形成产生抑制作用。