基于荧光共振能量转移效应构建复合荧光纳米探针快速检测食品中的沙门氏菌

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沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的食源性人畜共患肠道致病菌,为肠杆菌科的革兰氏阴性短小杆菌,据报道共有2600多个血清型。由沙门氏菌感染引起的疾病在我国乃至世界范围内已经成为主要的公共卫生威胁。由于沙门氏菌主要通过污染食物进行传播,可导致急性肠胃炎、伤寒、败血症等多种疾病。沙门氏菌在食品安全风险预测和危害评估中一直都是重要的检测项目,因此,建立高效快速的沙门氏菌检测方法一直都是研究者们努力的方向,具有十分重要的现实意义。沙门氏菌检验的国家标准GB4789.4-2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》中规定了关于食品中沙门氏菌检测的标准方法,该方法需要4~7 d才能确定检测结果,操作步骤繁琐,检测周期长。本研究将磁珠和量子点等纳米材料与免疫学方法相结合,构建了用于沙门氏菌检测的关开型复合荧光纳米探针,根据该探针与金纳米间的荧光共振能量转移(FRET)效应建立了食品中沙门氏菌快速检测的新方法。取得的主要研究结果如下:(1)本研究首先通过将经硅烷化以及氨基化修饰的功能化磁珠与沙门氏菌特异性抗体进行偶联,制备功能化免疫磁珠,将其作为捕获探针快速富集沙门氏菌。通过傅里叶变换红外光谱对磁珠进行表征分析,证实Fe3O4裸磁珠已经成功包覆了二氧化硅外壳,且已修饰上氨基。为了探究不同抗体浓度对磁珠偶联的影响,通过紫外分光对其进行表征,确定了1 m L(10 mg/m L)免疫磁珠中沙门氏菌特异性抗体的最佳用量为200μL,此时偶联率最高,达91%。随后进行了不同量的免疫磁珠与沙门氏菌进行磁珠捕获性能比较试验,确定了免疫磁珠用量为10 mg时对沙门氏菌的捕获效率最高,可达98.52%。(2)将具有良好荧光性能的量子点作为荧光信号元件,通过将功能化磁珠、抗体和量子点进行有序组装,构建了集磁性富集分离和检测于一体的磁珠-抗体-量子点复合荧光纳米探针。采用紫外可见光谱(UV-Vis)和荧光光谱对制备的量子点进行表征,证明了包覆Zn S外壳的量子点荧光强度更高,其紫外吸收峰在456 nm处,荧光发射峰在516 nm处,通过Zeta电位仪对量子点的带电情况进行表征,确定了本研究制备的量子点电位值为-35.7m V,带负电荷。(3)基于量子点与金纳米间的FRET效应构建荧光关开检测体系,并进行透射电镜与紫外光谱表征,确定了制备的巯基乙胺修饰的金纳米胶体颗粒大小均匀、分散性良好,粒径为34 nm,浓度约为0.83 nmol/L,紫外吸收峰在523 nm处。通过Zeta电位仪对制备的金纳米带电情况进行表征,确定了本研究制备的金纳米电位值为+15.4 m V,带正电荷。满足由于静电作用两者可相互吸引从而发生静电自组装的条件,且通过荧光光谱对加入了金纳米的荧光探针进行表征发现,加入金纳米后,荧光探针的荧光强度明显下降,此时荧光探针的荧光被猝灭。(4)利用金纳米作为荧光猝灭剂,将复合荧光纳米探针的荧光猝灭后,加入目标菌后根据荧光的恢复情况建立快速检测体系,即通过荧光的关-开来实现沙门氏菌的定性和定量检测。通过对复合荧光纳米探针构建的沙门氏菌快速检测体系进行试验条件的优化后,确定了当猝灭复合荧光纳米探针的金纳米胶体最佳p H为8、稀释度为15倍时,金纳米对复合荧光纳米探针的猝灭效果最优。在最佳优化条件下,应用本研究构建的复合荧光纳米探针对沙门氏菌进行检测,建立了复合荧光纳米探针的荧光恢复度与沙门氏菌菌浓度对数之间的定量关系,结果表明两者呈线性相关,线性回归方程为y=103.5x+121.4(R2=0.9956),检出限为102CFU/m L(S/N=3),检测时间小于2 h,且检测结果与国标方法相对比,准确率达99%。本方法检出限低,受背景基质干扰低,灵敏度高,对目标菌的检测特异性强,耗时短,为沙门氏菌的快速检测提供了新的思路和平台。
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